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单位长度带有相等的电荷 * * 分子生物学实验 Western Blotting(14学时） 基因芯片鉴定大肠杆菌（14学时） 质粒DNA的转化（7学时） 限制性内切酶酶切和琼脂糖电泳鉴定（5学时） 实验内容 实验一 Western Blotting Blotting (印迹法） 是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测来检测样品的一种方法 Western blotting 是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测 Western blotting 可以定性或者定量检测蛋白质，还可以用来研究蛋白质亚基的分子量 原理 经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影进行检测 特点：蛋白质的Western blotting结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）的靶蛋白 Western blotting流程 底物显色 抗体杂交 封闭 样品制备 转膜 PAGE 上半部分实验 下半部分实验 本实验目的及过程 目的 检测正常人和肺炎和白血病人血清中的IgG量的变化以及计算IG亚基的分子量 过程 采用人血清为材料，对样品进行SDS后，通过电转移法将蛋白质转印到NC薄膜上，用兔抗人IgG作为第一抗体，用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体为第二抗体，在辣根过氧化物酶底物存在的情况下，检测人的IgG PAGE 原理 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（acrylamide，Acr）单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（N. N‘ methylene bis- acrylamide，Bis）通过化学催化剂过硫酸铵（ammonium persulfate，AP）以及加速剂四甲基乙二胺（TEMED）催化聚合作用形成的多孔三维网状结构。在此结构中在电场作用下，根据分子量大小，形状或电荷将被分离物质各组分分开。 Acr和Bis有神经毒性，可经皮肤、呼吸道等吸收，故操作时要注意保护 PAGE的分类 非变性PAGE 蛋白质在电泳中保持完整的状态，蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷 变性PAGE (SDS) 蛋白质电泳迁移率主要取决于分子量的大小，电荷和分子形状可以忽略不计‘’ SDSSDS是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，PAGE胶中加入SDS SDS是一种强变性剂,它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。 强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂从而破坏蛋白质的三、四级结构，使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子 蛋白质结合SDS后，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的净电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异‘’。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子量 蛋白质-SDS复合物 PAGE示意图 上电极液 下电极液 不连续缓冲系统vs连续缓冲系统 连续缓冲体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，具有电荷和分子筛效应 不连续缓冲体系中凝胶的浓度不同，缓冲液 pH不同，具有电荷，分子筛效应和浓缩效应 浓缩胶缓冲液为pH6.8的Tris-HCl，浓度小，孔径大 分离胶浓度大，孔径小，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl 浓缩胶 SDS测定蛋白质分子量 当蛋白质的分子量在15~200kDa时，蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系： lgMr=K-bx (Mr为分子量，k,b为常数，x为相对迁移率） 将已知分子量的标准蛋白质在SDS中的电泳迁移率对分子量的对数作图，即可得到一条标准曲线。只要测得未知蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量 蛋白质分子量的测定 相对迁移率=蛋白质分子的迁移距离（cm)/染料迁移距离（cm) 电泳槽装置 所有实验器材的照片均由沈老师提供 梳子 电泳槽 本 体 滑块 滑块 螺栓 电泳槽中的玻璃夹心 制胶架 凸轮 所用试剂 30％丙烯酰胺贮备液：29.2g 丙烯酰胺，0.8g 甲叉双丙烯酰胺，加重蒸水至100ml。 浓缩胶缓冲液：0.5mol/L Tris-HCl，pH6.8。 分离胶缓冲液：3mol/L Tris-HCl，pH8.9。 10％过硫酸铵(w/v)：临用前用蒸馏水配制。 10％SDS(w/v) 10％TEMED 电极缓冲液：甘氨酸 14.1g，SDS 0.5g，Tris 3g，加水至1000ml，pH8.3。每组配500ml