蛋白质说综合实验.ppt

蛋白质综合实验 蛋白质浓度测定介绍　 　　 四种古老的经典方法: 定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。 新的测定法: 考马斯亮蓝法（Bradford法）。 还有近来广为应用的蛋白定量方法——BCA法。 在选择方法时应考虑 ①实验对测定所要求的灵敏度和精确度； ②蛋白质的性质； ③溶液中存在的干扰物质； ④测定所要花费的时间。 紫外吸收法  较为灵敏； 快速；5～10分钟； 原理：蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在 280nm处的光吸收. 干扰物质：各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸 说明：用于层析柱流出液的检测；不消耗样品，测定后样品仍能回收利用. BCA（2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠）法 原理： 在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。两分子的BCA(在BCA反应液中）螯合一个Cu1+ ，形成紫色的反应复合物。该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性。优点：灵敏度非常高; 较快速40分钟内； 干扰物质：螯合剂；略高浓度的还原剂 说明：抗干扰能力强， 蛋白不可逆的变性 蛋白质含量的测定 （Lowry法） 实验目的 1.学习和掌握蛋白质含量测定的原理 2.掌握Folin-酚法（Lowry法）测定蛋白质浓度的操作技术 原理 蛋白质含有两个以上的肽键(—CO—NH—)，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与Cu2+形成紫红色络合物。Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂(磷钼酸—磷钨酸试剂)，蛋白质—铜络合物能还原磷钼酸—磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。 本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏10—20倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。 操作方法 血清蛋白的测定和标准曲线制作 试管编号 1 2 3 4 5 6 7 标准蛋白 (mL) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 － 稀释血清(mL) － － － － － － 1.0 0.9％NaCl(mL) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 － － 碱性铜溶液(mL) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 混匀后室温放置20 min。 酚试剂(mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 摇匀，30min后以0号试管为空白对照，在650nm处比色 . 层析法 实验目的 1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。 2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。 层析基本知识 层析定义 　 层析法又称色谱法，利用分离物质中不同组份的某些理化性质的差异而建立起来的一种分离技术． 　由固定相和流动相组成． 　 　层析分类 　　根据操作形式不同分类 　　根据分离机制不同分类 　　 凝胶层析 凝胶是一种具有多孔，网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小，形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析 。 小分子扩散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；大小分子分开：大分子行程较短,已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中。  分辨率不高，分离操作较慢。分子量的差异仅表现在流速的差异上，分离时流速必须严格把握。 对于分子量相差不多的物质难以达到很好的分离。 凝胶层析要求样品粘度不宜太高。凝胶颗粒有时还有非特异吸附现象。 常用的凝胶类型有: 交联葡聚糖(sephadex) 交联琼脂糖(sepharose CL) 聚丙烯酰胺凝胶(biogel P) 琼脂糖(biogel A) 多孔玻璃(bio glass) 聚苯乙烯(bio-beads)等。 Spandex G(10-200) （1）数大，交联度小，网孔大 （2）代表持水量，G-25，1g干胶持水2.5ml. 操作： 　装柱 　加样 　洗脱 　清洗 　凝胶回收 　　做思考题 实验结果 一、描述实验现象 二、分