流行性脑六脊髓膜炎实验室诊断.ppt

流行性脑脊髓膜炎实验室诊断 天津市卫生防病中心病原生物学部 井良义 何谓流行性脑脊髓膜炎？ 流行性脑脊髓膜炎（简称流脑），是由脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitides，Nm）通过呼吸道传播所引起的化脓性脑膜炎，常在冬春季节引起发病与流行,患者以儿童为多见，现在成年人发病有增多趋势。人受Nm 感染后大多数表现为鼻咽部带菌状态，只有少数成为流脑患者。 正常人群中Nm带菌率可达5～ 30%。，带菌者为流脑流行的重要传染源。 细菌经飞沫传播，患者潜伏期1～ 4天，其发展经过可分为三期：　　1.首先侵入鼻咽腔，引起上呼吸道感染，有时局部有炎症。　　2.少数细菌侵入血流，造成单纯 菌血症，可有突然发作的恶寒、发热、恶心、呕吐等，并可有出血性或红斑性皮疹，或称淤血点。　　3.大量细菌侵入，由血液或淋巴到达脑脊髓膜，引起脑脊髓膜炎的症状与体征，如头痛、呕吐、颈项强直、发热等一般脑膜炎症状。 适宜的检测样品 鼻咽拭子、血液、皮肤粘膜出血点挤出液、血清及脑脊液等。 其中脑脊液、血液、皮肤粘膜出血点挤出液中检出脑膜炎奈瑟氏菌可直接作为确诊依据。 样品采集与运送 样品采集（一） 脑脊液：无菌操作，吸出CSF 3~5mL，立即放到无菌试管内离心(2000～ 3000r/min，30min)，用灭菌过的毛细管吸取沉淀物直接接种到10％羊血巧克力色琼脂上(CSF上清液部分供检测Nm特异抗原，亦可将其置于－20℃待测)，5％二氧化碳环境37℃培养24～ 72h，每日检查细菌生长的情况，及时分离纯培养物供鉴定。 样品采集（二） 血液：采取病人急性期静脉血液6mL，无菌操作往盛有30mL增菌用的葡萄糖肉汤三角瓶内注入4mL血液(余下的2mL血液同上离心后吸出血清，供检测Nm特异抗原和抗体，亦可将其置于一20℃待测)，同上述条件培养24~72h，每日进行分离培养。 样品采集（三） 淤血点：选病人皮肤上的新鲜淤血点或淤斑，消毒后用针头挑破，挤出组织液，用无菌棉签蘸取先接种含双抗的葡萄糖增菌肉汤管中增菌8~12h后分离培养或直接接种10％羊血巧克力色琼脂；涂片，干后革兰染色，直接镜检。 样品采集（四） 咽拭子：用长柄棉拭子采咽后壁两侧分泌物，立即接种卵黄双抗培养基或巧克力双抗平板，也可将咽拭子放入液体双抗增菌管内，增菌8 ~ 12h后分离培养 。 咽拭子接种 咽拭子接种 不合格咽拭子接种 不合格咽拭子接种 样品的处理和运送 早期采集样品：应尽可能采集病人用药前的早期样品，这可以明显提高病原的检出水平。 及时处理样品：应尽可能地做到床边接种，若无可能则应在最短的时间内送到实验室进行接种培养。 保温运送：应尽可能保持样品处于20~36℃之间，切记不能低温运送（检测抗体的血清标本除外）。 流脑病原学检查方法 生长特性 脑膜炎双球菌为专性需氧菌，初次分离时需5~10%的二氧化碳环境才能生长，最适生长温度为37 ℃ 。 菌落特征及菌体形态 菌落：Nm接种于巧克力色琼脂平皿上，5%CO2，37℃ 培养24小时后，其菌落直径约1mm ，表面突起、光滑、湿润、圆整、略带灰白色、半透明、不溶血、无色素。 细菌形态：为革兰氏阴性，呈卵圆形和肾形，0.8×0.6大小。常成对排列，邻近两边扁平凹陷 菌 落 特 征 菌 落 特 征 脑 脊 液 涂 片 生化特征 分解葡萄糖和麦芽糖，产酸不产气。 不分离蔗糖、果糖和乳糖。 过氧化酶和氧化酶阳性 血清分群鉴定 检查从病人分离的疑似Nm时，先用多价Ⅰ、多价Ⅱ、多价Ⅲ抗血清检测，如果阳性再用分群血清（A群、 B群、C群、W135群抗血清等）检测。 不与盐水发生凝集，与一种脑膜炎抗血清发生凝集反应，即为某一型的流脑菌。 在盐水中发生凝集反应，不能作为抗血清分群。 菌种保存 短期保存：保存脑膜炎双球菌，用卵黄盐水保存，可保存7天。 2长期保存：最好方法是低温冷冻或冷冻干燥。所有的细菌都可在-70℃冰箱中冷冻保存。将脑膜炎双球菌接种巧克力平板中，放二氧化碳培养箱中35～ 37 ℃孵育18～ 20小时，收集细菌放到含1ml脱脂牛奶的2ml螺盖冷冻瓶中。将菌苔在管壁研磨振荡，使细菌分散在培养基中。-70 ℃低温冰箱分类保存。 流脑血清学检查方法（一） 玻片凝集试验:应用玻片凝集试验对Nm病原菌株或带菌者菌株进行血清学分群。Nm诊断血清：国产售品有多价Ⅰ（包含A、B、C、D群），多价Ⅱ [含1889（Y）、 1890（H）、1892（29E）]，多价Ⅲ[含319（W135）、1916（X）、1486（I）、1811（K）群]及各群单价血清，共计14种。（括号内为国际编码） 流脑血清学检查方法（二） 酶联免疫吸附试验（ELISA）：应用ELISA间接法测病人急性期和恢复期血清中抗A群