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多聚酶链反应PCR- polymerase chain reaction实时荧光定量PCR技术 利用DNA变性与复性原理在体外扩增特异DNA片段,在一个简单的试管中反应，用极少量基因组DNA作模板,在一对引物介导下，通过聚合酶链式反应，在短时间内即可将所需目的DNA片段扩增至100万倍以上 PCR技术 特点 敏感度高、特异性强、产率高、 重复性好、操作简便、快速 PCR工作原理 是以要扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5`末端和3`末端相互补的寡核甘酸片段为引物、在4种脱氧核糖核甘酸存在的条件下，依赖DNA聚合酶的酶促合成反应。 PCR特异性取决于人工合成的一对引物和模板DNA结合的特异性。 PCR体系基本组成 模板DNA： （102-5）拷贝 dNTP底物：20—200umol/L，过高将加快反应速度， 同时增加碱基的错误掺入率 特异性引物： 0.1—0.5 umol/L DNA聚合酶： Klenow T4 、 T7聚合酶 TaqDNA聚合酶具有良好的热稳定性。并具有5`-3`聚合酶活性及3`-5`外切酶活性，因此可以校正PCR反应中某些单核甘酸的错配。 含Mg2+的缓冲液： Mg2+ 能影响反应特异性和扩增片段的产率，一般为1.5—2.0mmol/L，过量将增加非特异性条带的产生。 反应分三步： 1 变性 denaturation： 加热90-95℃，模板DNA双链解离形成单链DNA； 2 退火 annealling： 温度突然降低,引物与模板DNA结合, 40-60℃,Tm值{4（G+C）+2（A+T）}-5℃. 3 延伸 extension： TaqDNA聚合酶以4dNTP为底物，在Mg2+ 存在 的条件下，催化DNA合成。 70-75℃时间---要扩增片段长度决定 引物设计原则 引物长度15-30bp 引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物G+C含量宜在45-55%左右。 引物的内部不应形成二级结构，两个引物间不应有互补链存在 引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。计算机分析。 引物3`末端碱基原则上与模板配对，3`末端碱基最好不是A。 引物5`末端碱基无严格限制，只要与模板DNA结合的引物长度足够，末端可以游离。因此可以在引物5`末端加上限制性内切酶位点。 PCR产物的检测 琼脂糖凝胶电泳；（EB） 分子杂交； 限制性内切酶酶切分析； 微孔板夹心杂交法； 直接测序 PCR技术应用 目的基因的克隆 基因的体外突变 DNA的微量分析 PCR技术结合分子生物学实验技术---PCR新技术， RT-PCR：用于RNA分析 PCR-SSCP：可用于点突变分析 热启动PCR：可提高特异性。 不对称PCR（asymmetric PCR） 多重PCR(multiplex PCR) 巢式PCR(nested PCR) 实时荧光定量PCR技术 实现了PCR从定性到定量的飞跃 实时荧光定量PCR原理 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 特异性更强、 有效解决PCR污染问题、 自动化程度高 实时监测反应过程 Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中重要的概念 —— Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数 Ct值与起始模板的关系 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 荧光定量PCR所使用的荧光化学 荧光染料 SYBR Green I 荧光探针 TaqMan荧光探针 Moleculae Beacons Scorpions TM探针 Lightcycler SYBR荧光染料 在PCR反应体系中，加入过量SYBR Green I 荧光染料，SYBR Green I荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 对引物质量要求较高 TaqMan荧光探针 PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭