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实验五BCA 法测定蛋白质浓度 武汉生物医学研究院 2013年4月3日 实验目的 了解BCA 法定量蛋白质浓度的基本原理 掌握BCA 法定量蛋白质浓度的实验步骤 学习酶标仪的操作方法 实验步骤 使用碧云天BCA蛋白浓度检测试剂盒 1. 先将solutionA 摇晃混匀，根据样品数量，按50体积solution A加1体积solutionB试剂（50:1）配制成BCA工作液，充分混匀。BCA工作液在24小时内稳定。 2.稀释标准品：完全溶解蛋白质标准品（25mg/ml BSA,-20℃保存）取20微升用PBS稀释至1000微升（样品一般可用PBS稀释），使终浓度为 0.5mg/ml。 实验步骤 3. 将稀释后的标准品（0.5 mg/ml）按0, 2, 4，6，8, 12, 16, 20微升分别加到96孔板的蛋白标准品孔中，加标准品稀释液补足到20微升。 实验步骤 4. 加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液补足到20μl。(将蛋白质样品作适当稀释) 5.?各孔加入200 μl升BCA工作液，用加样枪轻轻吹打混匀（注意：不要弄出气泡影响读数），37℃放置30-60分钟。 6.冷却到室温后，用酶标仪测定A562nm，或540-590nm之间的其他波长的吸光度，根据标准曲线计算出蛋白浓度。 请大家批评指正 武 汉 生 物 医 学 研 究 院 WUHAN INSTITUTES OF BIOMEDICAL SCIENCES 武 汉 生 物 医 学 研 究 院 WUHAN INSTITUTES OF BIOMEDICAL SCIENCES 武汉生物医学研究院 Wuhan Institutes of Biomedical Sciences 武汉生物医学研究院 WUHAN INSTITUTES OF BIOMEDICAL SCIENCES 武汉生物医学研究院 四种古老的经典方法： 凯氏定氮法 双缩脲法（Biuret法） Folin－酚试剂法（Lowry法） 紫外吸收法 新的测定法： 考马斯亮蓝法（Bradford法） 更新的测定方法： BCA法 蛋白质浓度测定方法 凯氏定氮法（Kjeldahl method，全称凯耶达尔定氮法）是分析化学中一种常用的确定有机化合物中氮含量的检测方法。这种方法是由凯耶达尔在1883年发明的。 在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定(16%)，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。 蛋白质浓度测定方法---凯氏定氮法 若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则样品中蛋白质含量（%）=总氮量×6.25??? 若样品中除有蛋白质外，尚含有其他含氮物质，则需向样品中加入三氯乙酸，然后测定未加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后样品上清液中的含氮量，得出非蛋白氮及总氮量，从而计算出蛋白氮，再进一步算出蛋白质含量。??? 蛋白氮 = 总氮 - 非蛋白氮 ??? 蛋白质含量（g %）= 蛋白氮 × 6.25 凯氏定氮法的普遍适用性、精确性和可重复性已经得到了国际的广泛认可，它已经被确定为检测食品中蛋白质含量的标准方法。 蛋白质浓度测定方法---凯氏定氮法 蛋白质浓度测定方法---双缩脲法 双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由1%氢氧 化 钾、几滴1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。当底物中含有肽键 时（多肽），试液中的铜与多肽配位，配合物呈紫色。其颜 色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨 基酸成分无关。 在一定的实验条件下，未知样品溶液与标准蛋白质溶液同时 反应，并于540~560nm测定，即可以通过标准蛋白质的标准 曲线求出未知样品的蛋白质浓度。 蛋白质浓度测定方法---双缩脲法 双缩脲试剂中真正起作用的是硫酸铜，而氢氧化钾仅仅是为了 提供碱性环境，因此它可被其他碱，如氢氧化钠所代替。向试 剂中加入碘化钾，可延长试剂的使用寿命 。 此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以 及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于 需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定 。 此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin-酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。 Folin-酚试剂法（Lowry反应）最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多。缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Foli