他克莫司生物合成相关基因研官究及其产生菌遗传改造-微生物与生化药学专业毕业论文.docx

2．1 2．1 改造菌株的发酵和液相分析 ．20 tcs7改造菌株的发酵和液相分析 ．．20 3 讨论 2 l 第三章初级代谢基因对FK506合成的影响研究 23 l 基因改造 23 1．1 PCR引物设计 一23 1．2 PCR扩增 ．．23 1．3质粒构建 ．．24 1．4工程菌构建 ．．26 2发酵与液相分析 ．．27 2．1删伫、bccA2基因增加拷贝数工程菌株的发酵和液相分析 27 2．2 gttD改造菌株的发酵和液相分析 ．．28 3讨论 28 第四章FK506生物合成基因的功能研究 30 l 基因改造 30 1．1 PCR引物设计 ．．30 1．2 PCR扩增 ．．30 1．3质粒构建 ．．3 1 1．4工程菌构建 ．．32 2发酵与液相分析 ．．32 2．1 基因增加拷贝数工程菌株的发酵和液相分析 32 3讨论 ．／I BM ．33 第五章外源颤血红蛋白基因对他克莫司产生菌生长影响 35 1 基因改造 35 1．1 质粒构建 一35 1．2工程菌构建 ．．36 2发酵分析 37 3讨论 。38 第六章结论 ．39 l转录调控因子编码基因对FK506合成的影响研究 ．．39 2初级代谢基因对FK506合成的影响研究 39 3 FK506生物合成基因的功能研究 ．40 4外源颤血红蛋白基因对他克莫司产生菌生长影响 40 5讨论与展望 40 参考文献 。42 III 万方数据 致 致 谢 ．44 文献综述 ．．45 免疫抑制剂他克莫司生物合成与发酵生物学研究进展 。45 1他克莫司产生菌 一45 2他克莫司生物合成机制 ．．46 2．1骨架的合成 ．．47 2．2特殊前体的合成 ．．47 2．3结构后修饰 ．．49 3他克莫司发酵营养学与菌种改造 ．50 3．1合成前体物对发酵水平的影响 ．．50 3．2遗传改造 ．．5 1 4发酵产物纯化 一5 1 5总结和展望 52 作者简历 55 IV 万方数据 中文摘要他克莫司(FK506)是由链霉菌产生的一种23元大环内酯类免疫抑制剂，是肝和肾等 中文摘要 他克莫司(FK506)是由链霉菌产生的一种23元大环内酯类免疫抑制剂，是肝和肾等 器官移植后抗排斥反应的一线用药，己在多个国家上市。然而作为一种微生物的发酵产 物，FK506存在效价低、副产物多等问题。因此，通过研究其产生菌中影响FK506生 物合成的相关基因，能够为通过基因工程改善该菌的发酵特性、降低生产成本等创造有 利条件。 本研究以链霉菌Streptomyces sp．TL01为出发菌株，研究了FK506生物合成及其转 录调控因子编码基因、次级代谢相关基因以及外源的颤血红蛋白编码基因分别对菌株发 酵和代谢产物生物合成的影响。以LuxR家族的转录调控因子编码基因]kbN，LysR家 族的转录调控因子编码基因tcs7，初级代谢途径中参与合成或消耗NADPH的酶编码基 因zwf2和gltD，催化乙酰CoA生成丙二酰CoA的酶编码基因bccA2，催化他克莫司生 物合成后修饰的C31位氧甲基化酶编码基因#bM，及用于提高菌株氧结合水平的颤血 红蛋白编码基因vgb等作为目标基因，借助分子生物学的手段，通过酶切酶连完成重组 质粒构建后，经大肠杆菌．链霉菌的属间接合转移，将构建好的质粒导入到受体菌 Streptomyces sp．TL01中，筛选获得基因工程菌后，摇瓶发酵考察其发酵特性。 HPLC分析显示：#bN倍增菌株发酵效价降低32％，]kbN基因敲除菌株不产FK506； tcs7的倍增菌株发酵效价降低了54％，敲除菌株发酵效价增加6％，发酵水平基本与出 发菌株相当；zwf2基因倍增菌株发酵效价增加13％；bccA2敲除菌株发酵效价降低9％； 而gltD的敲除使FK506的发酵效价增加135％；]kbM基因倍增菌株发酵效价增加13％； 而整合表达vgb的Streptomyces sp．TL01，其FK506发酵效价变化不大，但菌体干重明 显增加。 由结果推测俐可能为FK506生物合成所必需的负调控基因，tcs7则对他克莫司 的合成起负调控作用；zwf2和bccA2的倍增对他克莫司发酵单位影响不大；而gltD敲 除菌株发酵效价明显提高；#bM倍增菌株的发酵单位有所提升；Streptomyces sp．TL01 整合表达vgb基因后，在相同发酵条件下，菌株可以高密度生长，提高生物量。 研究初步确定-了JkbN、tcs7、zwf2、bccA2、gltD、JkbM及vgb等基因对TL01发酵 特性的影响，为多基因组合改造TL01菌株、优化其发酵特性奠定了基础，也为其它药 用微生物的菌种改良提供借鉴。 关键词：链霉菌，他克莫司，FK506，遗传改造 V 万方数据 AbstractTacrolimus，a Abst