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通过母系血浆的高通量平行DNA基因组测序来进行胎儿染色体非整倍性的无创产前诊断 前 言 染色体非整倍性是很多配偶选择做产前检查的主要原因。现在决定性诊断的方法主要靠破坏性的过程，比如绒毛膜取样和羊膜穿刺术，然而这些方法都有流产的风险。虽然胎儿的DNA可以在母亲的血浆中找到，但是作为其中非常微小的部分，总是伴随着大量母系DNA背景。因此胎儿基因组内的非整倍性染色体数量上的不同对于母亲血浆中全部的染色体序列表达就非常的微小。即使用非常精确的单分子计数方法比如数码PCR，为了达到必要的分析精度仍必须分析大量的DNA分子，即需要大量的母系血浆。这样我们就证明了使用独立位点的方法比定位于某一基因位点的方法将极大的提高从相同一定容量的血浆中可供分析的非整倍性染色体目标分子的数量。因此我们为了达到产前胎儿二十一三体综合症的无创检测，应使用高通量平行基因组测序来量化母系DNA序列。我们检测了28个怀孕六个月内母亲的血浆样本并正确辨别出了其中14个二十一三体综合征胎儿和14个整倍性胎儿，高通量平行血浆DNA测序展示了一个为所有孕妇进行无创产前胎儿染色体非整倍性诊断的新途径。 正 文 检测胎儿非整倍性是许多孕期妇女做产前诊断的主要原因。传统的产前检测方法包括绒毛膜取样和羊膜穿刺术，这些具有破坏性的取样方法有可能导致流产，因此许多人都在研究无创取样方法，其中超声波扫描和母亲血清的生物化学标记被证明是有效的筛选方法，然而他们发现的是负现象而不是染色体异常的病理学特征。这些方法也存在很大的局限性，比如妊娠期适用性和同时需要联合多个标记，甚至需要通过不同的时间节点来达到一个临床上有用的灵敏度和特异性。为了从母亲血样中直接检测胎儿的染色体和基因组异常，早期的工作聚焦于如何将稀少的胎儿有核细胞从母亲血浆中分离出来。1997年发现的母亲血浆中无细胞胎儿核酸开创了新的可能，然而胎儿DNA仅仅占母亲血浆DNA的很小部分。绝大多数都是孕妇自己的DNA，这点造成了巨大的挑战。最近，生物学家发明了大量的方法。一个策略以母亲血浆中胎儿特异性的核酸作为目标，比如说胎盘的mRNA和DNA分子创造了一个胎盘特异性DNA甲基化信号。胎儿的染色体剂量然后用目标分子中SNPs的等位基因比率分析来评估，这种策略叫做RNA-SNP等位基因比率法和表观遗传等位基因比率法。这种基于等位基因比率的方法只能用在被分析的SNPs位点上是杂合的胎儿中，所以为了提高这种方法的覆盖率需要多样的标记。 为了创造一种从母系血浆中检测胎儿染色体非整倍性的单独多态性的方法，我们团队最近提出了使用数码PCR来进行相关染色体剂量（RCD）测量的原则。数码RCD是用来数母系血浆中可能的非整倍性染色体的一个特殊位点的总数量，比如说二十一三体综合症中的二十号染色体，并且将其与参考染色体比较。因此我们检测到由三条二十一号染色体带来的基因位点与对照基因的微小增加时，我们就可以诊断出二十一三体综合症，二十一号染色体序列成比例的增加预期就很小，因为胎儿DNA在母亲血浆DNA中仅占很小一部分。为了可信的检测出这个微小的增加，需要高精度地分析和计数大量确定数量的二十一号染色体和由数码PCR试验定位的位点的对照染色体序列。因此当部分富集的循环胎儿DNA非常低，比如说在早期怀孕时，就需要大量的母亲血浆。另一种方法是进行多个遗传位点的多样化分析，然而多路复用的数码PCR法的优化十分具有挑战性。如果使用荧光标记，我们就能很快地分辨出不同位点的各种标记。 为了克服以上的限制，我们打算用一种独立于任何特定基因位点的方法来计量母系血浆中二十一号染色体序列的数量。当使用独立位点的方法时，非整倍性染色体的每一个DNA片段都会对这条染色体的数量的计量产生影响。因此对任何固定容量的母系血浆中可计量的序列都比特定位点基因试验中作为模版的DNA分子多，所以过量或较低的非整倍性染色体的表达更容易被精确地检测出。我们之前提议高通量平行基因测序（MPGS）平台会是无创产前胎儿染色体非整倍性诊断DNA序列的一种方法。在这份研究中我们证明＂Solexa＂测序技术（Illumina）可以实现这个目标。 结果 过程框架。母系血浆中的无创胎儿染色体非整倍性检测使用MPGS的过程框架按图示表达在图一中，在这份研究中我们使用了Solexa的合成测序方法。因为母系血浆中地DNA分子在自然条件下就已经变成碎片了，所以我们无需再将其碎片化。每个血浆DNA碎片的一个同源衍生拷贝的末端都进行了测序且用Illumina Genome Analyzer标准前测序生物信息学分析方法进行处理，后者使用了高效、大范围核苷酸数据库软件分析（ELAND）。这个测试的目的在于简单辨别测序血浆DNA碎片的染色体来源，但我们并不需要知道他们基因特异性位点的相关细节。每一个人类染色体上任何特定染色体的序列