实验九土工壤微生物的分离与计数.pptVIP

实验八 土壤微生物的分离与计数 ——涂布平板法 土壤是微生物生活的大本营 根据某微生物的生长条件（营养，酸碱度，温度，氧气等）而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于该菌生长，而抑制其他菌生长；用稀释涂布平板法获得单菌落（并不能绝对保证是纯培养，需要结合观察其菌落特征、个体特征，进一步分离纯化）。 三、实验材料 1、土样：选择某一生境土壤，去表层土，挖5~20cm深度 的土壤数10g，装入已灭菌的牛皮纸袋。 2、培养基: 牛肉膏蛋白胨培养基：细菌 淀粉琼脂培养基（高氏1号）：放线菌——每300ml培养基加入1ml3%的重铬酸钾抑制细菌和霉菌生长 马丁氏培养基：真菌——孟加拉红抑制细菌和放线菌 * * 一、实验目的 1、学习利用平板分离法从土壤分离微生物的基 本操作。 2、掌握微生物平板计数的方法。 二、实验原理 稀释到适量浓度 倾注或涂布平板 培养 菌落计数 将待测样品适当稀释，使其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释液接种到培养基上，经过繁殖每个单细菌长成肉眼可见的菌落，即一个菌落代表样品中的一个单细胞。 根据菌落数，稀释倍数，接种量可推算出原样品中的含菌数。 样品充分混匀； 同一稀释度三个以上重复， 取平均值； 每个平板上的菌落数目合适， 便于准确计数。 一般用菌落形成单位（colony forming units， CFU）来表示 原样品中的细胞数。 1、倒平板 2、土壤菌悬液的制备 四、实验方法 10g土样 + 90ml无菌水 振荡20min 3、梯度稀释 取1ml土壤菌悬液移入含9ml无菌水的试管中，吹吸均匀，为稀释10倍的样品，依次进行梯度稀释10-1~10-6 0.1ml菌悬液，涂布法分离 10-2、 10-3、 10-4 霉菌 0.1ml菌悬液，涂布法分离 10-3 、10-4、 10-5 放线菌 0.1ml菌悬液，涂布法分离 10-4 、10-5、 10-6 细菌 分离方法 稀释度 分离对象 4、涂布：取0.1ml适当浓度的稀释液涂布于相应平板，每个 稀释度做3个平行，每种菌需要做9块平板，及时 标记，涂布后静置10分钟。 5、培养 将细菌、真菌、放线菌培养基倒置于30℃培养箱中培养3-5d。 6、计数 7、挑菌（纯化） 将培养后长出的单菌落数量、形态、培养特征进行观察，分别挑取单菌落于相应平板上划线、分离， 培养，检查菌落是否一致、单纯（也可以用显微镜涂片染色镜检是否是单一的微生物），如有杂菌需进一步纯化、分离。 每毫升菌落形成单位＝同一稀释度的三次重复平均数×稀释倍数 ×5 平板计数 五、思考题 1、记录利用稀释涂布法对土壤样品进行活菌计数的结果。 10-4 10-3 10-2 稀释度 真菌 10-4 10-3 10-2 稀释度 放线菌 10-6 10-5 10-4 稀释度 细菌 重复 平均 3 2 1 平均 3 2 1 平均 3 2 1 平板中的CFU数 每克含菌样品中细菌/放线菌/真菌 活细胞数＝ （同一稀释度平板上菌落平均数× 10×稀释倍数） 含菌样品克数