identificationofplas命middna.pptVIP

Background Generation of linear plasmid DNA:(0.5ml tube） sample 5μl 10×buffer 2.5μl mix, (centrifuge) DDH2O 15μl Hind III 1μl Generation of PEC-CT fragment :(0.5ml tube） sample 5μl 10×buffer 2.5μl DDH2O 15μl mix, (centrifuge) BamH I 1μl Hind III 1μl incubate at 37℃ ,1h （1） 5μl plasmid + 15μl TE （2） 20μl Hind III digest of the plasmid （3） 20μl HindIII/BamHI digest of the plasmid add 4-5μl loading buffer，respectively maker (老师加，凝胶中留一孔） Standard DNA : （μg/μl） 1.00, 0.50, 0.25, 0.10, 0.05, 0.025, 0.01 Stand for 1h ，Take photo under uv light Determination of DNA conc. of the sample 按照复制性质，可以把质粒分为两类： 严紧型质粒Stringent plasmid: ：分子量较大的质粒 细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒；复制需要一个质粒编码的蛋白，质粒的拷贝数不能通过用氯霉素等蛋白合成抑制剂来增加。 松弛型质粒Relaxed plasmid :分子量较小的质粒 染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。 即使蛋白质合成受抑制（氯霉素等存在），质粒的复制依然进行。质粒的拷贝数可达2000～3000拷贝。 质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。 大多数基因工程使用松弛型质粒。 严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。 宿主细胞 可为原核细胞（大肠杆菌）；也可为真核细胞（人源细胞株） 原核宿主细胞按安全标准，应为限制酶和重组酶缺陷型，为大肠杆菌改造株 制备成最适摄取重组体的状态—感受态细胞 病毒载体-感染 质粒- 转化（原核） 转染（真核） pEC-ct plasmid: 8 kb in length carry genes CD (1.2kb) and TK(1.3kb) single endonuclease sites for EcoR I, BamH I, Hind III 二、分离质粒DNA方法 碱变性（裂解）法； 碱变性（裂解）法基本原理 加TE溶解后 再用酚、氯仿抽提，乙醇沉淀，TE溶解 三、DNA含量测定（半定量法） DNA测定：紫外分光光度计法（260nm） 半定量法：DNA与EB作用产生黄色荧光（紫外照射） 8 kb in length carry genes CD (1.2kb) and TK(1.3kb) 实验报告要求： 每一步骤分开叙述 原理在左 步骤在右 结果 可有结论 * * Determination of DNA concentration Identification of plasmid DNA Identification of plasmid DNA T K EcoR I BamH I C D Hind III Identification of the plasmid DNA Hind III 8kb Hind III and BamH I 1.2 kb 6.8 kb 8