第10章站真核生物的遗传分析.ppt

二、细胞学标记 染色体的变化常常会引起某些表型性状的异常，从而可以将染色体的变化作为一种遗传标记，来分析测定基因所在的染色体及相对位置，也可通过染色体置换等进行基因的定位 染色体数目的变化(如单体、缺体、三体、四体) 染色体结构的变异(如缺失、易位、倒位、重复等) 染色体核型(染色体数目、大小、随体有无、着丝粒位置等)和带型(C带、N带、G带等) 四、分子标记 遗传标记多态性形成的分子基础均是基因组DNA的变异，而分子标记所揭示的多态性是直接反映基因组DNA间的差异 1. 分子标记的优越性： 直接以DNA的形式表现 数量多，遍及整个基因组，检测位点近乎无限 多态性高，自然存在着许多等位变异，不需要专门创造特殊的遗传材料 表现为“中性”，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁 有许多分子标记表现为共显性 2. 分子标记技术分类： 一类是以分子杂交为基础的DNA标记技术，主要有限制性片段长度多态性标记(Restriction fragment length polymorphisms，简称RFLP标记)、可变数目串联重复序列标记(Variable number of tandem repeats，简称VNTR标记)、原位杂交(in situ hybridization)等 另一类是以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，简称PCR反应)为基础的各种DNA指纹技术 第三类是一些新型的分子标记，如单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，简称SNP)，表达序列标签(Expressed sequence stags，简称EST)和反转录转座子(Retro-transposon)等 RFLP标记 RFLP(restriction fragment length polymorphism)称为限制性片段长度多态性，是指用限制性内切酶酶切不同个体的基因组DNA后，含有与探针序列同源的酶切片段在长度上的差异 RFLP标记的原理 (2)RFLP标记的特点 无表型效应 RFLP标记具有共显性的特点 RFLP具有种族特异性 RFLP标记范围遍及全基因组 RFLP标记不足之处 DNA量大(5～15ug) 检测步骤繁琐，需要的仪器、设备较多，周期长 用作探针的DNA克隆其制备与存放较麻烦 检测中要利用放射性同位素(通常为32P)，易造成环境污染 虽然也可以用非放射性物质(如Biotin系统，Dig系统及Ecl系统)替代同位素，其杂交信号相对较弱，灵敏度较同位素标记低得多且价格较高 (二) PCR标记 PCR是Mullis等(1985)首创的在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的体外酶促反应，以合成特异DNA片段的一种方法 , 其特异性取决于引物与模板DNA结合的特异性 2. PCR的扩展 单引物PCR标记 随机扩增多态性DNA标记(Random amplification polymorphism DNA，简称RAPD标记)：引物为10个随机核苷酸组成 任意引物PCR标记(Arbitary primer polymerized chained reaction，简称AP-PCR标记): 引物长度与一般PCR引物相当，开始退火温度低允许错配，后正常PCR，具有随机性 单重复序列中间区域标记(Inter simple sequence repeats polymorphisms，简称ISSR标记)：在SSR引物端加2-4个简并核苷酸组成，具有较好的随机性和稳定性 RAPD标记 RAPD标记是用随机排列的寡聚脱氧核苷酸单链引物(通常长度为10个核苷酸)通过PCR扩增染色体组中的DNA所获得的长度不同的多态性DNA片段 RAPD与经典PCR区别 SSR(Simple Sequence Repeat) Nakamura(1987)发现生物基因组内有一种短的重复次数不同的序列，统称可变数目串联重复序列(Variable number tandem repeat, 简称VNTR )。VNTR标记包括小卫星(minisatellites)标记和微卫星(microsatellites)标记 微卫星DNA又称SSR(simple sequence repeats),它是一类由1～6个碱基组成的基序(motif)串联重复而成的DNA序列，如(CA)n、 (AT)n、(GCT)n、(GATA)n等重复，其中n代表重复次数 SSR分子标记的特点 数量几乎无限，检测出多态性的频率极高 SSR一般检测的是一个单一的多等位基因位点 SSR标记为共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子 结果重复性高，稳定可靠。为了提高分辨力，通常使用可检测出单拷贝差异的聚丙烯酰胺凝胶电泳 兼具PCR反