工具酶发和基因载体.ppt

③人工构建的?噬菌体载体有两种类型： a. 插入型载体（insertion vectors)： 只具有一个外源DNA插入限制酶位点，如 ?gt10、?gt11、?BV2、?NM540、?NM1590、?NM607 1）免疫功能失活型： 插入位点位于载体合成活性阻遏物区域（cI基因）内。 EcoR I cI ?gt10 插入导致载体不能合成阻遏物，?载体DNA不能进入溶源期，受体菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。 没有外源DNA插入的?载体感染受体菌形成混浊噬菌斑。 选择标记: 如?NM1149载体的两个克隆位点（EcoR I 和Hind III）都是位于cI基因内部。 2）?-半乳糖苷酶失活型载体： 在?基因组中引入了LacZ序列。（其上含有一个EcoR I 克隆位点）。 感染LacZ突变的大肠杆菌，经IPTG的诱导，利用Xgal的显色反应作选择标记。 LacZ EcoR I Charon16A 选择标记: b. 替换型载体（substitution vectors) 两个多克隆位点区以反向重复形式分别位于?DNA的非必须区两端。 用酶切后，可以将中间的区段切下来，与用同样酶切成的外源DNA片断置换。 可置换区 MCS MCS 如： ? EMBL4、Charon40等。 ? EMBL4 ? EMBL4的可置换片断内部还有Sal I酶切位点。 以便于进一步消化中间片断，防止自我连接。 左臂 可置换区 右臂 EcoR I BamH I Sal I Sal I BamH I EcoR I Sal I Sal I ?EMBL4 比一般的质粒载体的容量大的多。 用在真核生物基因组文库的建立。 Sau3A BamHI (4)?DNA载体的优点 1978年J. Collins和B. Hohn等人发展出cosmid vector（cos site-carrying plasmid)。指含有抗性基因、单一克隆位点及? DNA cos位点的细菌质粒。 ? DNA： 4—6kb （1）大小 （2）组成 cos序列和控制包装的的序列。 pBR322： 质粒的复制子 抗药性基因 几个限制性酶的单一位点 2.3.2.4 黏性质粒载体或柯斯质粒载体 pHC79 ①具有?噬菌体的特性： （3）cosmid vector的特点 克隆外源DNA后可以体外包装成噬菌体颗粒。 在寄主细胞内形成环化DNA（但不能形成新的噬菌体颗粒而溶菌 ）。 ②具有质粒载体的特性： 大多带有pMB1或ColE1的复制子，能像质粒一样复制。 有抗生素抗性基因，和插入失活的克隆位点。 ③方便的选择： ④高容量的克隆能力： 45kb （最少不能低于30kb）。 51kb-5kb=45kb （4）部分cosmid vector Cosmid 载体 复制子 大小（kb) 选择标记 克隆位点 克隆能力（kb) c2XB pMB1 6.8 Ampr, Kanr BamHI, ClaI, EcoRI, HindIII, PstI, SmaI 32~45 pHC79 pMB1 6.4 Ampr , Tetr EcoRI, HindIII, SalI, BamHI, PstI, CalI 29~46 pHS262 ColE1 2.8 Kanr BamHI, EcoRI, HincII 34~50 pJC74 ColE1 15.8 Ampr EcoRI, BamHI, BglII, SalI 21~37 pJC75-58 ColE1 11.4 Ampr EcoRI, BamHI, BglII 16~42 pJC74m ColE1 21 Ampr, Kanr BamHI 16~32 pJC720 ColE1 7.1 Elimm, Rifr HindIII, XmaI 11~28 Cosmid 载体 复制子 大小（kb) 选择标记 克隆位点 克隆能力（kb) pJC81 pMB1 7.1 Ampr, Tetr KpnI,BamHI,HindIII,SalI 30~46 pJB8 ColE1 5.4 Ampr BamHI,HindIII,SalI 31~47 MuA-3 pMB1 4.8 Tetr PstI,EcoRI,BalI,PvuI, PvuII 32~48 MuA-10 pMB1 4.8 Tetr EcoRI,BalI,PvuI,PvuI 32~48 pTL5 pMB1 5.6 Tetr BglII,BalI,HpaI 31~47 pMF7 pMB1 5.4 Ampr EcoRI,SalI 32~48 应用cosmid载体在大肠杆菌中克隆大片端的真核基因组DNA技术，叫“柯斯克隆”（cosmid cloning）。 （5）cos