第十七章自免疫学的应用2.pptVIP

间接免疫荧光法检测自身抗体和病原体抗体 * 1、免疫酶标记技术??  用酶标记抗体或抗抗体进行的抗原抗体反应。以底物被酶分解后的显色深浅来反应待检样品中抗原或抗体的含量。 (1)常用酶：辣根过氧化物酶（HRP） 碱性磷酸酶（AP） (2)常用方法：酶联免疫吸附试验 * ELISA原理示意图 * 间接法 * 双抗夹心法 * 抗原竞争法 * 免疫荧光技术 　 常用荧光素： 1、异硫氢酸荧光素（黄绿色荧光）FITC,495nm 2、罗丹明（红色荧光）RB200 3、R—藻红蛋白 R-PE * 免疫荧光技术（可在同一标本中测多个抗原或抗体） * 放射免疫分析法? 　 同位素分析的灵敏性 ＋ 抗原抗体反应的特异性 优点： 灵敏度高 特异性强 精确性好 样品用量少 测定方法规范、自动化 常用同位素： 125I、131I、 3H、14C、32P * 放射免疫测定 WESTERN 原理 * 免疫胶体金技术 * * * * * 快速斑点免疫金渗滤法检测示意图 * 常用抗原抗体反应的相对敏感度 （/L） 血清蛋白电泳（区带电泳） 1000mg 免疫电泳 50～100mg 单向免疫扩散〈10～20mg 双向免疫扩散 〈10mg 火箭电泳 〈5.0mg 对流免疫电泳 〈1.0mg 免疫比浊 1.0mg 补体结合反应 10ug 凝集反应 10ug ELISA 〈10ug RIA 〈 10ug * 二、免疫细胞的检测 在体外或体内，对机体免疫细胞进行鉴定、计数、功能测定。 1、免疫细胞的分离 自然沉降法 密度梯度离心+花环试验（或黏附试验等） 免疫磁珠法 图 流式细胞分离术 图等 * Percoll分层液? * * 流式细胞仪分离细胞 * 2、免疫细胞的计数 图 各种血细胞? 1.2.3.单核细胞 4.5.6.淋巴细胞 ? 7.8.9.10.11.中性粒细胞 12.13.14.嗜酸性粒细胞 15.嗜酸性粒细胞 16.红细胞 17.血小板. * 流式细胞仪检测细胞表面标记 * * 3、免疫细胞功能的测定 (1) 淋巴细胞转化试验 形态学方法、淋巴母细胞计数、3H-胸腺嘧啶核苷掺入法、MTT检测法等 (2)细胞毒试验 CTL、NK、LAK细胞等 混合淋巴细胞培养 (3) T细胞功能的体内检测（迟发型超敏反应） 皮肤试验、接触性过敏反应 5、细胞因子检测 ELISA、生物活性测定、PCR * * * 胶体金颗粒是将氯金酸（HAuCl4）用还原法（白磷、抗坏血酸、枸橼酸三钠等）制成的。它为带负电荷的疏水胶，其颗粒是单个散在的，根据需要可制成直径几纳米到几十纳米大小，呈桔红色。抗原或抗体蛋白质借助表面电荷，很容易包被到胶体金颗粒表面，形成标记颗粒，用于检测相应的抗体或抗原。 第三节 免疫检测 * 一、抗原、抗体的检测 抗原抗体反应，又称血清学反应（主要指体外的反应）。 （一）抗原抗体反应的特点 1、特异性和交叉反应 2、可逆性(分子表面的结合) 非共价键结合 ( 范德华力∝分子空间构型的互补程度、静电引力、氢键、疏水性作用 ) 是分离纯化抗原或抗体的理论依据 * 3、比例性和可见性 比例不合适——出现游离的抗原或抗体，小分子的免疫复合物形成，加电解质也不可见； 比例合适——出现网格状的大复合物，游离的抗原或抗体少，加电解质，可见； 因此，在抗原抗体反应中，为得到肉眼可见的反应现象，需要调整抗原、抗体的比例。 4、阶段性 ①抗原抗体特异性结合阶段，短 ②可见反应阶段，长 * * 抗原抗体反应的主要影响因素 1、抗原和抗体浓度、比例 2、电解质 在可见反应阶段发挥作用，0.85%NaCl。 3、温度 常选用37度，也有4度。 4、pH 一般在pH6~8。 * （二）血清学反应的种类 1、凝集反应（agglutination