等电聚思焦电泳.pptxVIP

等电聚焦电泳张素芳;背景介绍;基本原理; 如果在电泳系统中建立一个由阳极至阴极，pH由低到高（即环境由酸到碱）的连续而稳定的pH梯度，则处于一个系统的各种蛋白质分子，将根据各自的pI值与所处位点的PH值的差别带上正电或负电。;载体两性电解质pH梯度(carrier ampholyte pH gradient)等电聚焦，即在电场中通过两性缓冲离子建立pH梯度。 固相pH梯度(immobilized pH gradients,IPG)等电聚焦，是利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物滴定时，在滴定终点附近形成pH梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合，形成固定的、不随环境电场条件变化的pH梯度，分辨率可达0.001pH。 载体两性电解质/固相pH梯度混合技术，即在固相pH梯度凝胶中加入载体两性电解质作为添加剂，被称为“杂交等电聚焦”。 固相pH梯度等电聚焦与载体两性电解质等电聚焦的区别在于前者不是两性分子，在凝胶聚合时便形成pH梯度.后者是两性分子，在电场中两性分子迁移到自己的等电点而形成pH梯度。;pH梯度的形成;加入附加物质建立pH梯度。通过把一些有机溶剂如乙醇、甘油等加到缓冲液中，利用附加物的介电常数的变化，改变了缓冲液一些组分的解离常数，可以形成1.5pH单位的pH梯度。如在硼酸盐溶液中加0~5%甘油和0~3%蔗糖，可以形成pH为7~8.6范围的梯度，可分离血红蛋白。 在电极间放入含多种不同等电点电解质的溶液，通电后在电极间便会形成pH梯度。这些两性电解质大多是一些多胺基多羧酸化合物。为了防止对流对pH梯度的干扰，可以采用加入不同浓度的中性或惰性物质形成密度梯度的方法，也可以采用在电极间加入凝胶的方法。 利用固定化两性载体形成pH梯度。就是把具有缓冲能力的基团或化合物用共聚或接枝的方法固定在载体上形成两性载体。载体可以是聚丙烯酞胺凝胶或葡聚糖等。被固定的化合物可以是带羧基的酸或带叔胺基的碱。采用这种方法可以形成稳定的pH梯度。但成本太高。 ;固定化两性载体和两性缓冲液相结合。 利用离子交换剂建立pH梯度。Sluyterma(1978)利用离子交换剂建立一个有pH梯度的柱进行等电聚焦，称为色谱聚集。 由外循环建立的pH梯度，Rilbe(1978)在两电极??把溶液进行循环，以在电泳分离室中建立一个稳定的pH梯度，称为流动电解。 缓冲液更新的方法。在电泳过程中，溶液的离子会产生电迁移。在两个电极室中离子的消耗或积累，可由外部加和或取出加以平衡，以维持电泳池中缓冲液的组成和pH等流量泵不变。;两性介质载体的选择;电场下载体两性电解质的变化;pH梯度支持介质;循环流动等电聚焦示意图;分段固定化pH梯度装置示意图;常用电泳仪;简单操作步骤;等电聚焦电泳的优缺点;pH梯度不稳定现象;等电聚焦电泳的应用;谢 谢！