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含油污泥中石油降解菌 的分离及其降解特性;;;二、材料与方法 1.实验材料 1.1含油污泥 含油污泥样品来源于渤海油田钻井岩屑，取自中海油渤海公司环保技术服务分公司，经测定油泥的含水率为70. 55 % ，pH为6. 4,盐度3. 0%。 1.2培养基 富集分离培养基 斜面固体培养基 含油液体培养基 ;2.实验方法 2.1降解菌的分离和形态观察 利用富集培养基和斜面培养基对菌种进行分离纯化培养。将分离纯化培养得到的菌株使用扫描电镜进行形态观察。 2.2菌株的鉴定 菌株采用16S rRNA基因序列分析的方法鉴定到属。 2.3降解菌的最适降解条件测定 采用单因素实验进行操作，分别改变温度、盐度和pH条件进行培养。 2.4总石油烃（TPH）的降解 TPH的测定采用超声萃取—紫外分光光度法测定。 2.5石油烃不同组分的降解 用二氯甲烷萃取添加菌液处理7d的含油污泥，用于硅胶柱层析，分别用30 mL正己烷、50 mL正己烷-二氯甲烷(体积比1:1)洗脱，所得到的饱和烃、芳香烃组分用事先称重的圆底烧瓶接取。计算石油烃降解菌对饱和烃和芳香烃的降解率。 然后将称重后的芳香烃和饱和烃组分用适量正己烷完全溶解，旋转蒸发至适量后氮吹至1 mL装入样品瓶进行GC—MS检测。 ;三、结果与讨论 3.1降解菌的分离和形态 从含油污泥样品中分离纯化得到3株石油烃降解菌，编号为RS1，RS2和RS3。 通过扫描电镜观察RS1为椭圆形，RS2和RS3为短杆状。 3.2菌株的16sRNA基因鉴定 测定结果显示3株细菌的16sRNA基因序列长度分别为1422、1433和1415bp。将得到的基因序列与GenBank数据库中的序列进行比对，获得各序列的同源性信息（表1）。 ;3.3菌株的最适降解条件 3.3.1最适降解温度 由图1可以看出，RS1在实验所选的温度范围内对石油均有超过10%的降解，其降解的最适温度范围为27 ~42℃，37℃时其对石油降解率最高;RS2降解的最适温度范围为32 ~37 ℃，32℃时RS2对石油降解率最高;RS3在42℃时石油降解率最高，其降解的最适温度范围为32 ~ 42℃ 。 ;3.3.2最适降解盐度 由图2可以看出，RS1对盐度的适应性较好，在盐度为0. 5%~5%的环境下对石油烃具有25%以上的降解率;RS2和RS3的降解最适盐度范围均为0.5% ~3%。在5%的较高盐度条件下，只有RS1的降解率依然高于25 % 。;3.3.3最适降解pH pH对降解率的影响如图3所示，可以明显看出RS3在碱性环境下对石油烃的降解效果远远好于其他两株菌，其降解的最适pH范围可达6~10 ，RS1和RS2只适应中性环境，降解的最适pH范围均为6~8。;3.4降解菌的降解特性 3.4.1降解菌对油泥中TPH的降解 相对于只添加营养的对照组，实验组油泥TPH均有明显降低，RS1, RS2和RS3作用于油泥，TPH的降解率分别为39. 69% ,31. 13%和53.29%，而混合菌的降解效果明显高于单一菌株，降解率为58.08% 。3株菌对TPH的降解均在实验进行到20 d左右开始趋于缓慢。如图4所示。 本实验结果也表明，混合菌的降解效果明显好于任何单一石油烃降解菌株。;3.4.2菌株对石油烃不同组分的降解 如图5所示，3株石油烃降解菌均表现出对饱和烃有较好的降解，其中，RS1对饱和烃的降解率最高，达20. 74%;而3株菌对芳香烃降解效果不如饱和烃，其中RS3对芳香烃的降解率最高，达到8. 08% 。混合菌对饱和烃和芳香烃的降解能力均高于任意单一菌株，降解率分别为24. 65%和10.77% 。 结果表明，降解菌对饱和烃的降解效果均明显好于芳香烃。;3.4.3 PAHs的GC—MS分析 混合菌对萘、苊、屈和苯并[b]荧蒽的降解能力较强,分别达到44. 39% , 27.79% , 30. 78%和39. 43%，而对其??PAHs的降解效果则不明显。;3.4.4正构烷烃的GC—MS分析 对混合菌液处理7d的含油污泥中正构烷烃进行GC—MS分析，与对照组相比，油泥样品中的正构烷烃n-C12~n-C34均有明显降解。对其中n-C12~n-C15、 n-C27~n-C34的降解效果较好。;四、研究结论 (1)从渤海油田含油污泥中分离出石油烃降解菌RS1, RS2和RS3，通过16S rRNA基因序列鉴定，分别为棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)、短杆菌属(Brevibacterium sp.)和假单胞菌属(Pseudomonas sp.)。 (2)确定3株细菌对石油的最适降解条件分别为37 ℃、盐度3% ,pH 8;32 ℃、盐度1%,pH 8;42℃、盐度1 % ,pH 6。其中RS 1对温度和盐度的适应性较好，RS3