人多能干细胞分化而来的平滑肌前体细胞治疗压力性尿失禁大鼠的研究-妇产科学专业论文.pdf.docxVIP

博士学位论文人多能干细胞分化而来的平滑肌前体细胞治 博士学位论文 人多能干细胞分化而来的平滑肌前体细胞治 疗压力性尿失禁大鼠的研究 博士研究生：王哲 指导教师：全松教授 摘 要 背景：压力性尿失禁(Stress urinary incontinence，SUI)是指在咳嗽、喷嚏、大笑等 腹压增高时出现的不自主地尿液渗漏。SUI是女性最为常见的尿失禁类型，尤其是 老年妇女。SUI症状经常发生在日常活动中，因此严重影响患者的生活质量和社交 活动，亦带来心理精神负担。SUI发病机制尚不明确，但尿道固有括约肌功能不全 (Intrinsic sphincter deficiency，ISD)是导致SUI的重要因素。ISD主要由于尿道括 约肌的平滑肌层或横纹肌层或其支配神经出现损伤引起。具有ISD的SUI患者通常 有更严重的尿失禁症状，且对常规的治疗反应不佳。当保守治疗失败后，必须进行 手术治疗。目前首选的手术治疗方式，如中段尿道悬吊术等，仅是增加对尿道的支 持、固定作用，并不涉及对损伤或老化的尿道括约肌进行组织重建。而这类手术的 长期成功率约为40．50％，有很大一部分患者会出现术后复发的情况。手术的局限 性及逐渐进展的尿道括约肌平滑肌层老化衰退被认为是导致术后复发的原因。因 此，有效恢复受损的尿道括约肌是需要积极探索的重要治疗方式。 干细胞因其具备自我更新和多向分化的潜能，可应用于SUI患者的尿道括约肌 再生，这引起了研究领域的极大兴趣。目前，已有成体干细胞(肌肉来源、泌尿系 来源、脂肪来源、骨髓来源等)在SUI动物研究或临床研究中表现出在排尿功能的 恢复、组织学的改善方面有较好的效果。但是，这些成体干细胞的临床应用仍存在 T 万方数据 中文摘要众多问题，如提取的自体干细胞数量有限、细胞扩增准备时间过长、移植细胞为多 中文摘要 众多问题，如提取的自体干细胞数量有限、细胞扩增准备时间过长、移植细胞为多 种细胞类型混合、携带表观遗传改变等等。这些障碍不利于干细胞疗效的优化，也 影响了我们对干细胞具体作用机制进行深入研究。因此，为避免上述问题，人胚胎 干细胞或诱导多能干细胞或许可以成为新的干细胞来源。另外，现阶段的干细胞实 验主要修复的是尿道外括约肌(横纹肌)，尚未有仅针对尿道内括约肌(平滑肌) 再生的研究报道。研究人员发现，在SUI研究中应用最广的成体间充质干细胞在体 内仅有一小部分能够分化为平滑肌细胞，而由于成体间充质干细胞移植混杂有多种 细胞类型，分化而来的平滑肌细胞是否对尿道括约肌功能重建有促进作用及有关机 制都无法明确。 目的：我们试图探索人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells，iPSCs)分化而来的单一平滑肌前体细胞(Progenitor smooth muscle cells， pSMCs)对重建SUI动物模型尿道功能的作用及机制。首先，通过在不同时间点对 不同SUI大鼠建模方式的建模效果进行比较，以期找到更稳定更适宜干细胞移植研 究的长期SUI模型。在此基础上，分化而来的pSMCs在移植入SUI大鼠尿道周围 一段时间后，根据LPP和尿道外周括约肌肌电图(Electromyography，EMG)基线 的测试，判断尿道功能的恢复情况。根据尿道括约肌组织学检查、细胞外基质 (Extracellular matrix，ECM)主要组成弹性纤维和胶原纤维的蛋白比较、移植细胞 体内融合实验等分析平滑肌前体细胞恢复尿道功能的作用机制。 方法：1、根据终末观察时间的不同将150只产后SD大鼠随机分为三个独立实验： 1周短期观察实验、4周和8周长期观察实验。每个实验中，大鼠随机分为对照组、 尿道松解组、耻骨一尿道韧带损伤(Pubo．urethral ligament injury，PULI)组和多次阴 道球囊扩张组(Multiple vaginal distention，MVD)。除对照组及1周短期实验中的尿 道松解组和PULI组外，其余组均在手术的同时附加了双侧输卵管卵巢切除术 (Bilateral salpingo—oophorectomy．BSO)。1周短期观察实验通过Crede法对三个时 TT 万方数据 博士学位论文间点进行漏尿点压力(Leak 博士学位论文 间点进行漏尿点压力(Leak point pressure，LPP)测试：术前、术后立即和术后一 周。4周和8周长期观察实验通过Crede法和垂直．倾斜板(vertical tilt tabel，VT) 法在术后4周和8周的终末时间点对LPP进行测试。术后8周LPP测试后收集大 鼠的尿道进行组织学分析。2、108只成年未经产的Rowett裸鼠随机分为四组：对 照组(无干预)、生理盐水组(手术+生理盐水注射)、膀胱平滑