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基因工程涉及的主要技术;基因工程;基因工程的操作流程;基因工程主要技术;一、DNA和RNA的提取和纯化;DNA提取的几种方法;基因组DNA-CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）; CTAB法流程图;质粒DNA－碱裂解法;对数期菌体; 蛋白质的去除： 酚/氯仿抽提 使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等） 高盐洗涤 蛋白酶处理 多糖的去除： 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。 用多糖水解酶将多糖降解。 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μL DNA液中加入200μl 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。 ;多酚的去除： 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合 盐离子的去除： 70％的乙醇洗涤 ;总RNA的提取;二、凝胶电泳;常见的凝胶电泳;琼脂糖凝胶电泳;聚丙酰胺凝胶电泳;三、基因扩增技术---PCR反应;1. PCR的发明;2.PCR的发展过程： 开始使用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段，该酶不耐热，每次加热变性DNA后都要重新补加。耗时、费力、易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得自动化 ;3.基本原理;双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。;TGCATGCAT;DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链。;理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA。; 总体积 50-100 ?l Buffer 缓冲液 dNTP 原料 Primer 引物（0.1-0.5 ?mol/L） DNA分子 模板 （50-100ng ） Taq酶 DNA聚合酶（0.5-2.5 U/50 ?L ） ;5. PCR的应用;在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。;五、分子杂交;核酸分子杂交;探针标记;（a）;; 1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩DNA印迹杂交技术十分类似，所以叫做诺赛恩RNA印迹技术（Northern blotting）但它不需要限制性内切酶切割。用于基因表达的特异性分析和定量分析。 而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质的抗体进行反应，这种技术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（Western blotting）。;原位杂交：是将分子杂交与组织化学相结合的一种技术。它是利用标记的已知核酸探针，在组织、细胞及染色体上检测特异的DNA或RNA序列的核酸杂交技术。如菌落和噬菌斑印迹法(colony and plaque blotting)；;五、DNA测序技术;　　双脱氧链终止法是现在应用最多的核酸测序技术，由Sanger等1977年提出。主要用于DNA基因分析。;DNA测序的自动化;二、Maxam-Gilbert化学分析法; 常规的基因工程技术的研究方法：除了凝胶电泳技术、核酸分子杂交技术、PCR技术、DNA 测序技术，还涉及细胞转化、文库构建、酵母双杂交技术等。 ;噢噢噢！;与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列互补（ 5‘端相同）的短DNA。;即2.75?1011 bp的基因组中有一次完全与19个核苷酸的序列相同的机会（或机会是约2×10-11）。;引物的碱???序列;3）避免形成引物二聚体（dimer）;尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力;⑤引物的Tm值;;但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。; dNTPs 是 dATP、dTTP