第四章蛋白类酶六的分离纯化.ppt

第四章 酶的分离纯化 1、酶分离纯化的原因（3条） 2、酶分离纯化鉴定的依据－蛋白质的物理化学特性（9条） 内 容 1、酶的提取与分离纯化技术路线 2、细胞破碎 3、酶的提取 4、酶的分离方法 5、酶的组合分离纯化策略 6、酶的浓缩、干燥与结晶 酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。 酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。 提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。 为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。 为了使蛋白质充分溶解并保持蛋白质的结构与活性，蛋白质提取缓冲液常包含的成分 控制溶液pH值的缓冲对； 控制溶液离子强度的无机盐； 控制溶液氧化还原状态的还原剂； 蛋白酶抑制剂 离子螯合剂 标准牛血清白蛋白 去污剂 水和防腐剂 甘油 大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象。 3.4 酶的分离方法 在一定的温度和pH值条件下（β为常数），通过改变离子强度使不同的酶或蛋白质分离的方法称为Ks分段盐析； 而在一定的盐和离子强度的条件下（KsI为常数），通过改变温度和pH值，使不同的酶或蛋白质分离的方法，称为β分段盐析 公式 logS = logS0-KsI=β-KsI 在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。这是由于硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。然而用硫酸铵进行盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子的存在会干扰蛋白质的测定，所以有时也用其它中性盐进行盐析。 在盐析时，溶液中硫酸铵的浓度通常以饱和度表示（指溶液中加入的饱和硫酸铵的体积与混合溶液总体积的比值） 解读蛋白质工程p204页表7－3 有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。例如，20℃时水的介电常数为80，而82％乙醇水溶液的介电常数为40。 溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。 常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等 离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。 在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。 常速离心机又称为低速离心机, 其最大转速在8000 r/min以内，相对离心力（RCF）在1×104 g 以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。 高速离心机的最大转速为（1～2.5）×104 r/min ，相对离心力达到 1×104～1×105 g ，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。有些高速离心机装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机 超速离心机的最大转速达 (2.5～12)×104 r/min，相对离心力可以高达 5×105 g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。 超速离心有三种： 差速离心：采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒分批分离的方法 密度梯度离心：使沉降系数比较接近的物质得以分离的一种区带分离方法。必须预先配制好适宜的密度梯度系统离心前将样品小心地铺放在预先制备好的密度梯度溶液的表面。（密度相近，分子量不同）梯度较浅，密度较低 等密度梯度离心：分离密度不同的颗粒，欲分离颗粒处于密度梯度中的等密度点（平衡）才可停止离心，操作时先把一定浓度的介质溶液与样品液混合均匀。（密度不同，分子量相近）梯度陡峭，密度较高 密度梯度离心前用密度梯度混合器预先配制密度梯度系统，贮液室与混合室的截面积关系决定梯度类型。 配制中，将稀溶液置于贮液室B，浓溶液置于混合室A, 如图4-2(郭勇酶工程p96） 流出的梯度液经过导管