转基因植物技术不的鉴定.ppt

转基因植物技术的鉴定 组员：魏翠芳、杨帆、甘小东、孙圆圆、 王翠华、张辉、曹盼、王凯、罗青帮 田晓瑞、马小莉、王亚平、袁源 转基因技术 将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术（Transgene technology）。 技术路线 目的基因分离 植物表达载体的构建 受体材料的准备 遗传转化 转化组织 组织脱分化 转化植株筛选 炼苗 1.目的基因的分离 （1）已知基因的获得 ①化学合成法 ②PCR扩增 （2）未知基因的获得 ①构建基因组文库，筛选目的基因 ②构建cDNA文库，筛选目的基因 ③mRNA差异显示技术筛选差异表达基因 ④差异蛋白质谱表达技术筛选功能基因 …… ① ② pGEM-T ③ ④ ⑤ ⑥ ⑥ ⑦ ⑧ ①银杏叶RNA提取 ②反转录cDNA ③chs全长cDNA的克隆 ④TA克隆及测序 ⑤向chs两端引入酶切位点 ⑥双酶切 ⑦定向克隆 ⑧导入农杆菌 2.植物表达载体的构建 3.受体材料的准备 细胞的全能性：分化细胞脱分化 再分化 4.遗传转化 （1）间接转化法——农杆菌介导转化法 （2）直接转化法 A、 基因枪转化法 B、 电击法 C、花粉管通道法 D、 PEG介导基因转化法 根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens),是一种革兰氏阴性土壤杆菌,它含有Ti质粒,能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤,即诱发冠瘿瘤.Ti质粒(包括Ri质粒)上有一段转移DNA,在农杆菌侵染宿主植物时,这段DNA可以转移进植物细胞,并稳定地保留在植物细胞染色体中,变为植物细胞新增加的一群基因,最终能通过有性世代遗传给子代 。 但进去的DNA片段整合效率极低，不易获得再生植株，可能发生共抑制现象. 基因枪转化法由美国Cornell大学的Sanfor (1987)提出,它的主要原理是将包含目的基因的载体包被在微小的金属微粒(钨粒或金粒)表面,通过高压驱动力加速微粒穿透植物细胞壁,导入受体组织细胞内,然后通过组织培养再生出完整的植株.微粒上的外源DNA进入细胞后,整合到染色体上并得到表达,从而实现基因的转化.。 电击法的主要原理是将原生质体在溶液中与DNA混合,然后利用高压电脉冲作用,使原生质体膜的某些部位被击穿而产生可回复的小孔,外源DNA可通过小孔进入原生质体内,而且不影响经电击处理的原生质体再生植物的能力. 转化效率较低，且仅限于能由原生质体再生出植株的植物。 花粉管通道法是利用开花植物授粉后形成的花粉管通道,直接将外源目的基因导入尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞,实现目的基因转化. PEG介导基因转化的主要原理是聚乙二醇(PEG)、多聚-L-鸟核苷酸(pLO)、磷酸钙及高pH值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子.PEG可促使细胞膜与DNA间接触与粘连,并通过引起膜表面电荷的紊乱及干扰细胞间的识别,利于细胞膜间的融合以及外源DNA进入原生质体. 表1 几种植物转基因方法比较 转基因方法 转化的优点 转化的缺点 DNA间接转化法 农杆菌介导基因转移 受体种类，可以在原生质体、蛋细胞和细胞团、组织器官或整株等多级水平上进行，方法成熟可靠，简便易行，周期短，转化率高； 转化双子叶植物为主。大多数单子叶植物和裸子植物对农杆菌的侵入不敏感，限制了该法在禾谷类作物中的应用。 转化体常出现“嵌合”现象，需在严格条件下加以选择以淘汰未转化细胞 DNA直接转化法 （1）基因枪转化法 （2） 电击法 （3） PEG介导基因转化法 （4）花粉管通道法 无宿主限制，适用于各种单、双子叶植物，操作简单 转化效率低，需要专门设备（电击仪、显微操作仪或基因枪），多数需要原生质体与愈伤组织，周期太长（电击法） 5.转化组织 ——农杆菌介导之叶盘转化法 带有转化基因的农杆菌活化 受体植物 叶盘 侵染 共培养 筛选培养 诱导成苗 预培养叶盘，或愈伤组织 遗传转化主要的影响因素： 1.预培养时间：一般0~3天，过长不利于侵染 2.农杆菌浓度：用MS（pH=7.0）盐溶液调OD值（一般在 0.2~1.0） 3.侵染时间：时间应适中，太短转化率低；太高则后期农杆菌难以除净，毒害材料。 4.共培养时间 5.乙酰丁香酮（AS）处理：处理方式及浓度 (A) 仅共培养基中加AS (B) 仅菌液中加AS (C) 菌液和共培养基中均加AS AS使用浓度：50μM~200μM 实验结论：A与C效果最好且差异不明显 6.炼苗 7、转基因植物的鉴定 个体水平鉴定 个体水平上鉴定利用