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* 突变类型： 简单的插入或缺失 系统的缺失、插入或成串碱基的置换 单个碱基的置换 第七章 定点诱变 site-directed mutagenesis of cloned DNA 第一节 寡核苷酸介导的诱变 oligonucleotide-mediated mutagenesis 70年代初 ?×174 DNA(ss DNA 5386bp),当用带琥珀突变的 ss DNA与变性的野生型DNA片段一起转染细菌时, 观察到“标记获救”现象 即产生带野生型基因组的噬菌体，原因是野生型DNA片段与突变体的相应序列退火，形成错配的异源双链体，后者可被宿主编码的错配修复系统转变为全长的野生型基因组。由此可利用突变的DNA片段将突变引入到野生型DNA中。 dut- dUTP酶缺陷，细胞不能把dUTP转化为dUMP, 因此细胞内dUTP的含量大为增加，其中一些 dUTP可掺入DNA中正常情况下由胸苷嘧啶占据的位置 一、Kunkel 法 或称“U”法 ung- UDG酶缺陷, UDG酶[尿嘧啶(uracil) -N-糖基化酶(glycosylase)]可除去掺入DNA中的尿嘧啶残基 1．背景知识 dut- / ung- 合成的 DNA含有尿嘧啶，M13噬菌体DNA中将含有20-30个尿嘧啶碱基 E.coli CJ236 dut, ung, thi, relA; pCJ105(Cmr) pCJ105 is a F’ plasmid Vector M13mp18 pTZ18U/19U 2860bp U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U Insert target DNA 转化 E.coli CJ236 M13K07感染 Isolate phagemid ss DNA 与突变寡核苷酸退火 T4 or T7 DNA polymerase / ligase 转化MV1190 dut+/ung+ 2．原理 (1) DNA polymerase T4 , T7, Klenow(可能会替换引物) 65% 11/13 (84.6%) 36% 突变率 (2) ligase 3U/13?l 可有可无，有则效率高 (3) T4 gene 32 protein 提高含二级结构的ssDNA的突变率 3. 酶和primer (4) primer 要求5’端磷酸化 引物的终极条件： 与靶DNA正确配对 特异性地与靶DNA序列退火 A. 单核苷酸置换插入 or 缺失 5’端完全配对，使得上游(引物)起始的DNA合成不容易将诱变寡核苷酸取代，约需8-10bp 3’端所形成的杂交体足以引导DNA合成。如果错配核苷酸太靠近3’端，3’端将不能形成稳定的杂交体，易被外切活性降解。所以3’端需有7-9bp完全配对; 为便于筛选，应选用可形成稳定杂交体而长度最短的诱变寡核苷酸。一般17-19bp, 错配在中央，使得完全配对的杂交体与错配杂交体之间的热稳定性差异足够大。 B. 多处缺失或变换2个bp以上的oligo 两侧需12-15bp 侧翼双链区的Tm应约为35-40℃ Tm=4(G+C)+2(A+T) =36℃ ( 3 each) 突变区域大, 效率越低(两侧形成稳定杂交体的能力是突变区长度的函数→ 越低） (5) 模板/结果 靶DNA尽可能短，应测序确定其突变 载体 pTZ series M13mp18 pUC118/119 二、Altered Sites ? II in vitro Mutagenesis System 三、Transformer Site-Directed mutagenesis 四 、 PCR定点诱变 1．同源重组法 2．DpnI法 3.重叠延伸 Overlap extension *