基因操作原天理05.ppt

Taq Pwo Long sys 0.9kb 1.1kb 2.9 4.8 6.3 科学出版社 C.W.迪芬巴赫 /G.S德维克斯勒，1998 C．W．Dieflenbach/G.S.Dueksler 五、PCR介导的诱变 (一) PCR随机突变 每循环Taq错配率在0.1～2×10-4之间。 20-25cycles后，每个核苷酸产生的累积错误率达10-3,但对于构建一个具有不同序列的变异库仍然不够，特别是1kb的片段。 原因：在普通条件下，具较大定向错配即AT对变GC对。 设计出一种致突变PCR法，使错误率达7×10-3，且无倾向性。 ① Mg2+→7mM ② Mn2+→0.5mM ③ 提高dCTT/dTTT到1?M，促进错误掺入 ④ 提高Taq酶量，促进延伸链在碱基错配位置继续延伸 DNA shuffling, DNA 改组, 无引物PCR DNase I 处理DNA片段， 分子进化 (二)PCR定点诱变 1．同源重组法 在一般宿主内发生同源重组, 但需高转化效率 1x109/ug 2．DpnI法 DpnI只切割甲基化的DNA,　在PCR扩增后，可切除模板DNA从而使得用突变引物扩增出来DNA保存下来 Gene in plasmid with mutation target site Denature plasmid and annealing primers containing desired mutation Mutagenic primers Temperature cycle to extend and incorporate mutation primers resulting in nicked circlar strands transform Digest parental DNA template After transformation, XL1-Blue E.coli cell repairs nicks in plasmid Transform the resulting annealed double-stranded nicked DNA molecules Mutated plasmid 对于两个具有部分重叠序列的DNA片段，在经过变性和复性后，两个DNA片段之间通过同源序列形成部分杂合的双链，在DNA聚合酶作用下，杂合双链可互为引物和模板，引导DNA的合成，从而形成杂合DNA双链 3.重叠延伸 Overlap extension (三)SOE 重叠延伸剪接术 Splicing by overlap extension 可用于将两个 DNA片段在所期望的位点进行连接 设计一个寡聚体引物，其序列包含两个部分，“引发”和“重叠”部分，引发部分在3‘末端，起引物作用；重叠部分在5’末端，与待融合的DNA片段序列互补。 设计另一个引物，该引物与上一个引物完全互补 下图为将某基因的启动子与另一个基因的编码序列连接示意图 ATG ATG ATG ATG ATG ATG EcoRI BamHI BamHI ATG EcoRI ATG BamHI ATG EcoRI PCR PCR 重叠延伸 PCR 六、PCR鉴定和诊断 (一) 普通诊断 以一对引物或几对引物，加以对照， 检测样品中的DNA的存在 医疗，商品，法医 (二)等位基因鉴定 若多个相似基因共存，设计一系列系列对其进行鉴定，如 Bt crystal protein genes 1Aa 1Ac 1Ab (三) RAPD 随机扩增多态性DNA random amplified polymorphic DNA 用任意引物（AP, arbitrarily primered PCR）进行基因组指纹分析是检测DNA多态性的一种通用方法，对遗传学、图谱绘制,系统发育学和种子群生物学都很有用 随机选择的引物在一定反应条件下产生DNA指纹，反应条件只要求引物能起始DNA合成，而不管此时引物和模板的配对是否完全，有些引物起始的DNA合成发生在两条相对的DNA链上，其中最有效的那些反应在扩增过程中互相竞争而产生指纹，有的只有几个主要PCR产物，有的则包括100多个. · 以成对混合方式使用10碱基引物 模板DNA 平均10kb，但DNA一致更显重要 ·引物需经过筛选 （四）AFLP 扩增片段长度多态性 amplified fragment length polymorphism ·酶切总DNA e g. E.coRI ·加酶切点接头