基因操作原咬理08.pptVIP

反转录酶 AMV (42℃) M-MuLV (37℃) RNase H RNase H弱 长mRNA 引物 oligo(dT) 12-18 一般要求浓度高 模板 氢氧化甲基汞预处理，减弱链内二级结构 RNase 抑制剂 AAAAAAA mRNA 5 3 TTTTTTTT 二、cDNA第一链的合成 cDNA 1．自身引导法 三、cDNA第二链的合成 2. 置换合成法 有效 无须进一步纯化 不需用S1酶，否则会导致cDNA的大量损失 问题： 如何脱帽以便进入载体 5’端cDNA不能合成（少几个Nt） 有可能仍形成发夹结构 3. 第二链引导合成 Okayama-Berg方法 4. 引物-衔接头合成法 四、ds cDNA的分子克隆 1.同聚物加尾 问题： 只对质粒有效，文库不易保存和复制。 尾的长短不一 (100dA/dT, 20dG/dC) 同聚尾结合的质粒：cDNA杂合分子转化E.coli的效率随宿主不同而不同。 2．合成接头和衔接头 cDNA 合成接头 (含酶切位点) 酶切 NotI, SalI 与载体连接 Optional: methylation 接头中含稀有位点，如NotI, SalI(100kb一次) 先甲基化ds cDNA，再连接接头 用衔接头替换接头 用衔接头替换接头 3. 其他方法 (1) mRNA-cDNA杂交体克隆 mRNA cDNA AAAA AAAA RNA 末端加尾效率 只及DNA的1/10 合成第一链后, 加尾, 与带dT尾的载体退火, 在宿主体内, 可除去RNA, 代之以DNA 优点: 无须合成第二链, 序列完整 但效率 1/10 (2) 依次连加 不同接头 (3) RACE random amplification of cDNA ends cDNA克隆是常出现丢失末端序列的现象，需较长时间获得全长cDNA克隆 筛选文库时一般只能回收一个或几个cDNA克隆， 而RACE可产生大量独立克隆 mRNA cDNA TTTTTTTT-QI-QO AAAAAAA A. 经典RACE 3‘末端克隆 TTTTTTTT-QI-QO 反转录 QO PCR GSP1 QI GSP2 根据已经得到的不完整的cDNA的序列设计引物 GSP1 和GSP2 PCR cDNA克隆中, 得到了不完整的片段, 可采用此方法获得3‘末端和5’末端的序列 5‘末端克隆 mRNA AAAAAAA GSP1 GSP1 AAAAA Q1-Q2- TTTTTT Q1/ GSP1 PCR 反转录 Q2/ GSP2 PCR GSP2 获得的cDNA 克隆片段 AAAAAAA GSP1 反转录 连接RNA寡聚物 NNNNNNNN B. 新RACE (4) 其他与cDNA第二链合成有关的方法，如 Okayama-Berg方法和引物-衔接头合成法 五、cDNA克隆用的载体 1．?gt10和?gt11 ?gt10: 可用核酸探针 克隆0-6kb EcoRI 插入后载体变cI- cI+在hflA中发生溶原 GenBank: U02447 ?gt11：表达载体，可用免疫探针 克隆0-7.2kb 可表达融合蛋白LacZ E.coli C600 allowing growth of parental and recombinant phage C600hfl represses parental phage growth 50-100-fold, recombinant phage form clear plaques and parental phage form turbid plaques E.coli LE392 allowing growth of parental and recombinant phage Y1090 as the host, 42?C形成噬斑 适合用免疫学探针筛选 2. ?ORF8 9kb 可用于定向克隆 3．其它?gt18，19，20，21，22，23，?ZAP * 第八章 DNA文库的构建 DNA libraries 基因文库（Gene library）：由大量的含有基因组DNA（即某一生物的全部DNA序列）的不同DNA片段的克隆所构成的群体, 称之为基因文库。一个完全的基因文库，应该能够保证从中筛选到目的基因。 即 Genomic library 1976年L