绿色木霉耐热β-葡萄糖苷酶的分离纯化、酶学性质及结构表征-应用化学专业论文.docxVIP

优秀毕业论文 精品参考文献资料 摘要B 摘要 B一葡萄糖苷酶是纤维素水解的关键酶之一，但是目前纤维素酶生产菌株所 产p-葡萄糖苷酶普遍含量少、活性低，严重制约纤维素酶解技术的发展。本研 究以绿色木霉GIM3．139为试验对象，首先优化其发酵条件，在最佳发酵条件 下，分离纯化得到电泳纯的B．葡萄糖苷酶，进行酶学性质研究和结构鉴定，并 对其基因进行体外扩增、序列和活性位点分析，主要研究内容和结果如下： 1．通过单因素正交试验和响应面方法优化其产13．葡萄糖苷酶的发酵培养基 成分和发酵条件。确定最佳培养基成分为：乳糖3％，氯化铵0．1％，MgS047H，O 0．1％；最佳发酵条件为：接种量为5％，转速160 r／rain，装液量100 mL。在此最 佳条件下，p．葡萄糖苷酶酶活力为1．953 U／mL，较初始酶活提高了144％。 2．选用AKTA Purifierl00全自动层析仪Sephadex G．200凝胶柱对B一葡萄糖 苷酶粗酶液进行分离纯化，经SDS—PAGE电泳检测达到电泳纯，并研究了该酶 的酶学性质。研究发现，该酶最适反应温度为80℃，最适pH值为6．16，耐酸 碱稳定性好。金属离子中，Fe”、M92+、K+对B．葡萄糖苷酶的活性起抑制作用， 其中Fe3+对该酶的抑制作用最为明显，Fe2+、Mn2+对D．葡萄糖苷酶的活性起激 活作用，其中Mn2+对p．葡萄糖苷酶的激活作用最为明显。有机溶剂中，甲醇、 丙酮对该酶起到激活作用，其中甲醇的激活作用最明显，而乙酸乙酯对该酶具 有明显的抑制作用。 3．提取绿色木霉GIM3．139的基因组DNA，以其为模板利用PCR技术扩增 得到大小为2 278 bp的bgZ基因，并进行序列分析：该基因编码的B．葡萄糖苷 酶分子量约为78．214 3 kDa，含744个氨基酸残基，最可能的剪切位点预测在 第19位点和第20位点，且为分泌型蛋白；亲疏水性氨基酸分布均匀；该蛋白 是以伐螺旋5次跨膜；其二级结构为：无规则卷曲60．08％，B一折叠17．07％，u． 螺旋22．85％；利用在线软件PDBsumGenerate和Swiss—Model Workspace，分析 p．葡萄糖苷酶的活性位点，进行了三维结构的同源建模。 4．利用5 800 MALDI。TOF／TOF质谱系统进行分离纯化后B．葡萄糖苷酶的分 子量测定，测得D．葡萄糖苷酶的相对分子质量为57．628 17 KD。采用LC—MSMS 分析，得出了其N端22个氨基酸的种类。采用LC—MSMS进行C端测序，未 得到有效信息。利用圆二色谱测得p一葡萄糖苷酶的二级结构为无规则卷曲。 关键词：绿色木霉；3-葡萄糖苷酶；发酵条件优化；酶学性质；基因扩增； 序列分析；结构鉴定 万方数据 ABSTRACT13-glucosidase ABSTRACT 13-glucosidase is one of the key enzyme of cellulose hydrolysis．However，the development of cellulose enzymolysis technology was seriously restricted due to the low content and degradation activity of the 13-glucosidase．In this study，Tfichoderma viride 3．1 39 was research object，optimization of fermentation contions were investigated．Under the best condition，Electrophoretic pure 13-glucosidase was obtained．The enzyme properties and structure identification of 13-glucosidase were characterized，bgl gene in vitro amplification，sequence and active site analysis were also investigated．The main contents and resluts of this dissertation were as follows： 1．The culture medium and optimum fermentation conditions were optimized using means of single—factor orthogonal and response surface analysis test．The optimum m