以ltb为分子内佐剂的对prrsvgp时5蛋白免疫特性研究.docx

摘要本研究对PRRSV新型疫苗设计进行了新的探索，构建了以LTb为分子内佐剂的PRRSV-GP5 摘要 本研究对PRRSV新型疫苗设计进行了新的探索，构建了以LTb为分子内佐剂的PRRSV-GP5 融合蛋白，经动物免疫试验，阐明LTb的分子佐剂作用，为研究新型PRRS疫苗探寻新途径。主 要研究内容如下： 1．PRRSV ORF5基因的克隆、表达与免疫印迹 将PRRSV ORF5基因克隆入原核表达载体pET-28a(+)的多克隆位点中，经鉴定后得到重组质粒 pET—ORF5，将重组质粒转化到受体菌BL21(DE3)中，并用诱导剂IPTG进行诱导表达，2d,时后表达 量达到高峰。经15％SDS—PAGE电泳检测，表达得到的蛋白大小为13．75KD。经Western Blotting分 析，表达蛋白能与PRRSV阳性猪血清发生特异性反应，而与阴性血清不反应。 2．E coll LTb与PRRSV gp5融合基因克隆，表达与免疫印迹 采用PCR重叠延伸技术将LTb和PRRSV ORF5基因通过柔性连接进行融合后，克隆入原核 表达载体pET-28a(+)的多克隆位点中，经鉴定后得到重组质粒pET-LTb—gp5，将重组质粒转化到 受体菌BL21(DE3)q，，并用诱导剂IPTG进行诱导表达，表达蛋白2小时后表达达到高峰。经 15％SDS．PAGE电泳检测，表达得到的蛋白大小为26KD。经Western Blotting分析，表达蛋白均 能与PRRSV阳性猪血清发生特异性反应，而与阴性血清不反应。 3．gp5蛋白与LTb-gp5融合蛋白免疫效果的比较 将表达产物gp5蛋白及融合表达的LTb-gp5蛋白免疫6—8周龄ICR小鼠，并设对照组用间接 ELISA法和M丌法检测小鼠血清中特异性抗体水平以及脾脏中T、B淋巴细胞增殖功能。结果 gp5蛋白以肌肉注射途径免疫效果较好；三免后gp5特异性抗体达到较高水平，其中LTb—gp5 IM与 gp5+氟氏佐剂组之间差异不显著，而这两组与gp5 IM差异显著；从抗体种类来说，LTb-gp5三免 后达到和gp5+氟氏佐剂组相同的三种抗体亚型，而gp5 IM仍然是一种抗体亚型。LTb-gp5 IM、 gp5+氟氏佐剂组和gp5 IM均能够诱导脾脏T，B淋巴细胞增殖；LTb-gp5 IM、gp5+氟氏佐剂组 均显著高于gp5 IM。 4．大肠杆菌LTb蛋白单克隆抗体的制备和鉴定 将大肠杆菌不耐热肠毒素L17b基因去除信号肽后与载体pPIC9K连接，电转化入酵母菌 SMDll68中进行诱导表达。用纯化的LTb表达蛋白免疫6周龄BALB／c鼠3次，取脾细胞与SP2／0 骨髓瘤细胞进行融合后，以间接ELISA和有限稀释法进行筛选，获得4株能稳定分泌抗大肠杆菌 LTb单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为1F2，2C2，3D6，4H6株。经Western blotting分析，这几株 均能与大肠杆菌LTB表达蛋白产生特异性反应。抗体亚型鉴定结果表明，这四株均为IgG2a型。 关键词：LTb 佐剂PRRSV-gp5 免疫特性 AbstractIn Abstract In the present study,we explored the new vaccine design against PRRSV,We construct LTb -PRRSV-gp5 fusion protein，in animal inlmu．ne tests，we show the adjuvant LTb clarify role of the new—type PRRS vaccine for exploring new ways．Main contents follows： 1．Cloning，Expression and Identification of ORF5 of PRRSV The ORF5 gene of PRRSV was amplified by PCR with size of 375bp．The amplified DNA fragment was cloned into pMDl8-T,and sequenced．The result of sequencing showed that the consistency was 98％compared with that of standard strains．Inserted in pET-28a(+)，and transformed in Escherichia coli BL21(DE3)，the fragment was expressed after induced with IPTG；The results of SDSand Wes