免疫学基制本知识.ppt

　鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物。异鲁米诺衍生物ASEI和ABMI等也是常用的标记物。 2．吖啶酯（acridiniumester，AE）类这类发光剂不需催化剂的存在，在有过氧化氢的稀碱溶液中即能发光。反应式见电化学发光原理图： 　3．电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）反应在电极表面进行。发光底物为三联吡啶钌[Ru(bpy)32+]，另一反应物为三丙胺（TPA）。在阳电极表面，以上两化学物质可同时失去电子发生氧化反应（图18-1）。二价的Ru(bpy)32+被氧化成三价Ru(bpy)33+，TPA被氧化成阳离子自由基TPA+●，后者失去一个质子（H+），成为自由基TPA●，这是一个强还原剂，可将一个电子递给三价的Ru(bpy)32+*，而TPA自身被氧化成TPA氧化产物。激发态的Ru(bpy)32+*在衰减时发射一个波长为620nm的光子，重新生成基态的Ru(bpy)32+。这一过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，使信号得以增强。　 电化学发光原理 　 上式反应迅速，在1～5s内即可完成；具有背景低、信比高的优点，其检测极限可达5×10-9mol，发光量与AE浓度呈良好的线性反应，是一类的标记物。 第三节　化学发光免疫测定 　一、化学发光酶免疫测定 从标记免疫测定来看，化学发光酶免疫测定（chemiluminescentenzymeimmunoasssay，CLEIA）应属酶免疫测定。 测定中2次抗原抗体反应步骤均与酶免疫测定相同，仅最后一步酶反应所用底物为发光剂，通过化学发光反应发出的光在特定的仪器上进行测定。 两种常用的标记酶，辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）均有其发光底物， （一）HRP标记的CLEIA ： 常用的底物为鲁米诺或其衍生物。鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，通常以0.1mol/L pH8.6 Tris缓冲液作底物液，鲁米诺和H2O2在无HRP催化时也能缓慢自发发光，而在最后光强度测定中造成空白干扰，因而宜分别配制成2瓶试剂溶液，只在用前即刻混合。 HRP催化鲁米诺氧化的反应可被某些酚试剂（如邻－碘酚）或萤火虫荧光素酶等加强。加强剂的作用是增强发光和延长发光时间，由此可提高敏感度。 （二）AP标记的CLEIA 　在以AP为标记酶的CLEIA中，应用的底物为adamantyldioxetasephosphate，有不少衍生物的商品试剂如PPD可供应用。发光反应的反应式如下： 　二、化学发光标记免疫测定 化学发光标记免疫测定亦称化学发光免疫测定（chemiluminescent immunoassay，CLIA），是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的一类免疫测定方法。 用作标记的化学发光剂应符合以下几个条件： ①能参与化学发光反应； ②与抗原或抗体偶联后能形成稳定的结合物试剂； ③偶联后仍保留高的量子效应和反应动力； ④应不改变或极少改变被标记物的理化特性，特别是免疫活性。鲁米诺类和吖啶酯类发光剂等均是常用的标记发光剂。 鲁米诺类的发光反应须有催化剂（例如过氧化物酶）催化，且与蛋白质或肽结合后其发光作用减弱，因此鲁米诺类在CLEIA中是很好的底物，但已较少用于CLIA的标记。 吖啶酯类更为适用，其显著的优点： ①氧化反应不需催化剂，只要碱性环境中就可以进行。反应物在加入H2O2后再加氢化钠溶液，发光反应迅速，本底低。 ②在氧化反应过程中，结合物被分解，因此游离的吖啶酯的发光不受抑制。试剂稳定性好。 三、电化学发光免疫测定 在电化学发光免疫测定（electrochemluminescence immunoassay，ECLI）中应用的标记物为电化学发光反应的底物三联吡啶钌，其衍生物N-羟基琥珀酰胺（NHS）酯可通过化学反应与抗体或不同化学结构的抗原分子结合，制成标记的抗体或抗原。 ECLI的测定模式与ELISA相似，分二个步骤进行。以双抗体夹心法测定抗原为例： 第一步在试管中进行，反应物为Ru(bpy)32+标记的抗体、吸附在磁性微球上的固相抗体以及受检的标本，反应式如图。 ECLI中的抗原抗体反应 　 反应后除由标记抗体、固相抗体与标本中的抗原形成的夹心复合物外，尚有多余的标记抗体和固相抗体。 第二步是将反应液输入特殊的检测仪器的反应室中，随即用含三丙胺（TPA）的缓冲液冲洗。反应室电极下有磁铁。含磁性微球的夹心复合物及游离的固相抗体被吸附在电极表面，游离的标记抗体随冲洗液流出。此时在反应室中即发生电化学发光反应。发出的光由光电倍增管转为信号，通过电信号的测定反映标本中抗原的含量。 ECLI中的ECL反应 ECLI具有以下优点： ①标记物在再循环利用，使发光时间更长、强度更高、易于测定； ②敏