蛋白质不分离技术2.ppt

(1)靠近阳极端的载体两性电解质,电负性最强,具有较强的缓冲氢离子的能力,使环境的pH等于载体两性电解质的pI,一直向阴极顺延; (2)靠近阴极端的载体两性电解质,电正性最强,具有较强的缓冲氢氧根离子的能力,使环境的pH等于载体两性电解质的pI,一直向阳极顺延。 3. 毛细管电泳的分类 1、毛细管区带电泳（CZE） 2、分子体积排除（筛滤）电泳或 凝胶电泳（CGE） 3、等电聚焦电泳（IEF） 4、胶束电动力学电泳（MECC） 5、等速聚焦电泳（ITP） 4. 毛细管电泳的主要优点 1、高灵敏度 2、高分辨 3、速度快 4、进样少 5、成本低 高灵敏度：紫外检测器的检测极限在10-13—10-15mol之间，荧光检测可达10-19—10-21mol 高分辨：峰分离效率超过1百万理论塔板数，一般可达几十万。 速度快：许多分析在10分钟内完成。 进样少：一般需要毫微升的进样量。 成本低：一般只需要可长期使用的毛细管和极微量的可自己配制的缓冲液。 5.毛细管电泳的应用领域 小型离子 小分子 肽类 蛋白质 低聚核苷酸 DNA 毛细管电泳的应用选择 小型离子 小分子 肽类 蛋白质 低聚核苷酸 DNA CZE MECC CZE CZE CGE CGE ITP CZE MECC CGE MECC ITP IEF IEF CGE ITP ITP （二）电泳的基本原理 电泳是在电场的作用下而产生的物质运动，不同的物质在一定的电场强度下，由于所带电荷不同，因此受到的引力不同，向相反电极泳动速度不同进而达到分离目的。 若将带净电荷Q的粒子放入电场，则该粒子所受到的电荷引力为： F引= E Q （1） 在溶液中,运动粒子与溶液之间存在阻力F阻 F阻= 6πrηV 当F引=F阻时 EQ = 6πrηV V = 由上式可以看出,粒子的移动速度(泳动速度V)与电场强度(E) 和粒子所带电荷量(Q)成正比,而与粒子的半径(r)及溶液的粘度 (η)成反比。非球形分子（如线状DNA）在电泳过程中受到更大 的阻力，即粒子的泳动速度与粒子形状有关。 EQ 6πrη （2） （3） （4） 由（4）可知，带电粒子的泳动速度受电场强度影响，使得同一种带电粒子在不同电场里泳动速度不同。 在一次电泳中，蛋白质处在同一电场中，为了便于比较，常用迁移率 m（或称泳动度，指带电粒子在单位电场强度下的泳动速度）代替泳动速度表示粒子的泳动情况。 m = V/E = Q/6πrη （5） 由上式可以看出，在同一电场中，迁移率仅与球形粒子所带电荷数量、粒子大小及溶液粘度有关，而与电场强度无关。 EQ 6πrη （4） V= 以上讨论的是在溶液中进行的自由界面电泳的情况，在用支持介质的区带电泳中，除上述影响因素外，有效迁移率还受电渗（是指在电场中，液体对于固体支持物的相对移动）的影响。电泳时应避免用高电渗物质作支持介质。 最后要考虑选用离子强度适宜的溶液。离子强度影响粒子的电动电势，溶液的离子强度越高，由于溶液中的离子会分担大部分电流，则粒子的电动电势越小，泳动速度越慢，反之越快。 总之，电泳受粒子本身大小、形状、所带电量、溶液粘度、温度、pH、电渗及离子强度多种因素的影响。 （三）聚丙烯酰胺凝胶电泳 ?聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，对pH和温度变化小，没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。 ?聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（methylane bisacrylam