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第二章 基因克隆工具酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 核酸酶 核酸修饰酶 一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） 发现：1970年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出HindII和HindIII 功能：识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链。 限制性核酸内切酶的发现与应用导致了体外重组DNA技术的发展，使人们有可能将很大的DNA分子定向性地切割成较小的DNA片段，然后运用各种技术手段对其进行分析，从而能对生物体的基因结构、组织表达及进化问题进行深入的研究 来源：主要是从原核生物中分离纯化得到。到目前为止，已经从近300种不同的微生物中分离出约500种限制性核酸内切酶 一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） 生物学意义：限制性核酸内切酶，可以帮助细菌限制外来DNA的入侵 细菌中的防卫系统：限制与修饰现象 （1）细菌在其感受态的生理条件下，很容易吸收外源DNA进入体内。这种感受态可以是人为的，也可以是在自然条件下发生的。如果细菌不加限制地接受所有的外源DNA，细菌本身就会很快发生遗传变异甚至死亡。 （2）限制性核酸内切酶 （3）甲基化酶：对该特异位点的腺嘌呤A进行甲基化修饰，被修饰的DNA就不再被相应的限制酶切割了。 （4）细菌自身的DNA——受到甲基化修饰，得以保存 （5）外源入侵的DNA——未来得及甲基化，被降解 一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） 作为分子克隆宿主菌的大肠杆菌（例如DH5α），必须是 （1）rec基因缺陷型的突变体 保证必须不与同外来DNA分子发生遗传重组 （2）限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株 保证外来DNA分子不会受其限制酶的降解 Ⅱ型酶的作用方式在基因工程中具有十分重要的价值，是基因工程中常用的工具酶。 Ⅰ型酶、Ⅲ型酶的使用不如Ⅱ型酶方便，切割方式不如Ⅱ型酶那样令人满意，在基因克隆中实用价值不大。 H：细菌属名的头一个字母 in：细菌种名的头两个字母 Hin：表示了该菌的物种名称，用斜体 d：代表该菌菌株名称 III：表示该菌具有几个不同的限制与修饰体系，Ⅲ表示该酶是属于第三个限制修饰系统的酶 限制酶的识别序列与DNA的来源无关，不带有种的特征，对各种DNA都普遍适用。因此，甲种生物的DNA与乙种生物的DNA用同一种限制酶作用后，所形成的限制片段带有同样的末端，能够通过碱基的互补配对而连接起来。这是重组DNA技术的重要基础之一。根据这一特性，可以将不同来源的DNA重组成一种新的重组体分子。 限制酶切割DNA分子形成的短片段可以自发地重新连接成环状，这些环状分子经过加热又可以打开成线状 但如果在环化后加进DNA连接酶，在DNA片段之间的接口处将形成磷酸二酯键，这是一种较强的化学结合力，形成的环形DNA将是十分稳定的，即使再加热也很难再成线状，除非再次受到限制酶的作用。这说明，DNA经限制酶切割后再通过连接酶作用，得到的连接DNA是相当稳固的，这也是分子克隆技术的重要前提。 实验技术——核酸凝胶电泳结果处理软件quantity one 三、DNA聚合酶（DNA polymerase） 2. 大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ） 5‘ … G-C-T-G-OH 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P Klenow 5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-OH 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P P-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ OH-G-C-T-C … 5’ dATP dTTP P-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ OH-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’ （2）Klenow酶的基本用途1：补平由核酸内切酶产生的5’粘性末端 32 （2）Klenow酶的基本用途2： DNA片段的同位素末端标记 5‘ … G-C-T-G-OH 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P Klenow 5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-OH 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P P-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ OH-G-C-T-C … 5’ α-32P-pppdA dTTP P-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ OH-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’ 三、DNA聚合酶（DNA polymerase） 2. 大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Kle