第四章_猪的常见寄生虫病.ppt

预杂交的目的是用非特异性DNA分子(鲑精DNA或小牛胸腺DNA)及其他高分子化合物(Denhart’s溶液)将待测核酸分子中的非特异性位点封闭，以避免这些位点与探针的非特异性结合。 杂交反应是使单链核酸探针与固定在膜上的待测核酸单链在一定温度和条件下进行复性反应的过程。 杂交反应结束后，应进行 洗膜处理以洗去非特异性 杂交以及未杂交的标记探针，以避免干扰特异性杂 交信号的检测。膜洗净后，将继续进行杂交信号的检 测 第三步为杂交信号的检测。当探针是放射性标记时，杂交信号的检测通过放射自显影进行。即利用放射线在X光片上的成影作用来检测杂交信号。 操作时，在暗室内将滤膜与增感屏、X光片依序放置暗盒中，再将暗盒置—70℃曝光适当时间，取出X光片，进行显影和定影处理。 对于非放射性标记的探针，则需将非放射性标记物与 检测系统偶联，再经检测 系统的显色反应来检测杂 交信号。以地高辛的碱性 磷酸酶检测反应为例，地 高辛(Dig)是一种半抗原，杂交反应结束后， 可加入碱性磷酸酶标记的抗Dig抗体，使之在膜上的杂交位点形成酶标抗体—Dig复合物，再加入酶底物如氮蓝四唑盐(NBT)和5—溴—4—氯—3—吲哚酚磷酸甲苯胺盐(BCIP)，在酶 促作用下，底物开始显蓝紫色。 其基本反应程序类似ELISA，杂交信号的强弱，通过底物显色程度的深浅、有无来确定 二、DNA聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR) 1.基本原理 PCR技术是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸 存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。反应分三步。 ①变性 通过加热使DNA双螺旋双链解离形成单链DNA ②退火 当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要复杂的多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少 ③延伸 在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的条件下，5’—3’的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应 以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达2×106~7拷贝 2.PCR衍生技术 PCR可扩增双链DNA和单 链DNA，并能以RNA为模板，进行反转录PCR以扩增cDNA。经不断发展和完善，已有多 种衍生PCR技术。除反转录 PCR外，尚有不对称PCR、 反向PCR、锚定PCR、多重PCR、着色互补PCR、免疫 PCR和套式PCR等 另一个与PCR原理基本相似的重要方法为随机扩增多态性DNA（RAPD）。其基本原理是，在动物基因组中存在许多反向重复序列，以单个或以上的随机引物扩增DNA，引物可以和这些反向重复序列结合，产生长度不等的片段，从而进行多态性分析。 RAPD在本质上和PCR是一 样的，所不同的是，PCR引 物是专门设计的特异性引物，其扩增产物通常是预知的， 而RAPD的引物是完全随机的，只有10bp左右，与模板 的结合也是随机的，其扩增 产物不可预知。 PCR为了得到特异性产物，退火温度较高，RAPD为了得到更多的扩增条带，往往要降低退火温度，多为35~36℃，允许适当的碱基错配 目前，RAPD同PCR一样，已在许多寄生虫病的研究中得到了应用 第三节 分子生物学诊断技术 一、DNA探针(DNA probe) 技术 1.基本原理 DNA探针是带有标记物的 已知序列的DNA片段。DNA探针技术的基本原理是碱基 配对。在变性而成为单链的 被检DNA中加入变性的探针，随着温度的降低，探针便可 与被检DNA中的互补序列形 成双链，这一过程称杂交。 通过捕捉探针标记物释放出 的信号，便可知被检DNA中有无与探针序列相同的DNA每一种病原体都具有独特的DNA片段，通过分离和标记这些片段，就可制备出探针，用于疾病的诊断等研究 。 2.DNA探针的种类 按DNA探针的来源可分为 cDNA探针和基因组DNA 探针和动基体DNA(kDNA) 三大类 cDNA 探针 是将病原的mRNA反转录为DNA后获得的。其检测 的对象往往是在生命活动 中可以被激活并进行表达 的基因DNA 基因组DNA探针 来源于基因组。在寄生虫上常用基因组重复序列作为探针。这些重组序列在基因中高度重复，拷贝数很多，便于检出。但这些重复序列并不一定表达 kDNA探针 是较特殊的一类。在动 基体目原生动物中存在动 基体，内含大量环状DNA，分大环和小环两种。其中 小环拷贝数占绝对多数。 故往往以