拼接式毛细管电泳柱后蛋白质荧光衍生微膜反应器的构建与-分析化学.PDF

第43卷 分析化学 (FENXI HUAXUE)摇 特约来稿 第10期 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 2015年10月 ChineseJournal of Analytical Chemistry 1545~1550 DOI:10.11895/j.issn.0253鄄3820.140920 拼接式毛细管电泳柱后蛋白质 荧光衍生微膜反应器的构建与性能研究 张凌怡摇 任 俊摇 彭 丽摇 刘 翻摇 张维冰* (上海市功能性材料化学重点实验室,华东理工大学,上海200237) 摘摇 要摇 通过将两根柱端刻蚀的毛细管插入一小段聚砜中空纤维膜中,两根毛细管在膜内距离为零,构建了 拼接式毛细管电泳柱后蛋白质荧光衍生微膜反应器,研究了其衍生化性能。 拼接式微膜反应器中,衍生试剂 通过两根拼接毛细管之间的空隙进入反应池和目标物反应。 研究表明,与膜长0.3 ~1.0 mm非拼接式微膜 反应器相比,拼接式柱后衍生微膜反应器可保证衍生化试剂和分析物充分反应,有效改善柱效和检测灵敏度。 考察了分离电压(5~10 kV)及衍生试剂浓度等因素对衍生化反应的影响,并对荧光强度和蛋白质样品浓度 之间的关系进行了探究。 当运行电压为10 kV,衍生试剂为含有 1.5 mmol/ L2,3鄄萘二甲醛和60.0 mmol/ L 茁鄄巯基乙醇的100 mmol/ L硼酸盐缓冲液(pH9.5)时,在0.007~0.04 mg/ mL浓度范围内,荧光强度与蛋白质 浓度之间具有良好的线性关系,对标准蛋白BSA 的检出限可达5.6 nmol/ L。 与毛细管区带电泳/ 紫外检测结 果对比,此反应器几乎没有增加系统的死体积,柱效也无明显降低,具有良好的稳定性和重现性。 关键词摇 拼接式微膜反应器;毛细管电泳;柱后荧光衍生;蛋白质 1摇 引摇 言 毛细管电泳(CE)因其具有分离效率高、分析速度快、样品用量少、容易实现自动化等优点,在生物 样品的分离分析方面发挥着重要作用[1~4]。 但 CE 的检测光程一般较短,采用紫外检测灵敏度较低, 在一定程度上限制了其应用。 激光诱导荧光检测器 (LIFD) 以激光器为光源,更易于聚焦至微分析系 [5,6] 统的流通光路中,是CE 中灵敏度最高的一种检测器 。 高灵敏度的LIFD与高分辨率的CE分离技术 [7] 相结合,不仅可以提高检测灵敏度,还可改善选择性,在生物样品方面具有广阔的应用前景 。 [8] 目前,已知的蛋白质大部分没有自然荧光 ,使用荧光检测时通常需对蛋白质进行荧光衍生。 文 献报道的蛋白质荧光衍生化法主要有柱前衍生、柱上衍生、柱后衍生3种类型[9,10]。 柱前衍生是最常用 的衍生化方式,其衍生化过程和分离过程分别独立完成,样品经衍生化后被送入分离系统进行分离分 析,对衍生化产物的稳定性要求较高[11,12]。 柱上衍生为衍生过程和分离过程同时进行的衍生化方法, 缓冲液必须同时满足衍生化和分离的需求[13,14]。 无论柱前衍生还是柱上衍生,其衍生化过程都会带入 较多的杂质而影响检测结果。 柱后衍生法中,样品经CE分离后再与衍生化试剂发生反应,可避免杂质 及多重衍生峰对分离结果的影响,因此特别适合像蛋白质这种复杂且具有多反应位点的大分子的荧光 衍生。 柱后衍生反应器的制作是柱后衍生的难点之一,目前文献报道的柱后衍生反应器主要有间隙式、同 [9] 轴式和鞘流式等 。 间隙式柱后衍生反应器因其结构简单,已被大量应用于CE鄄LIFD 系统中,然而即 使扩散系数较小的大分子样品也会在间隙处产生损失,准直性问题造成的扩散损失也不容忽视。 中空