食管癌血清多肽标志和abcc4基因调控研究-细胞生物学专业论文.docxVIP

北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 目录 目录 Contents 图表索引 6 缩略语索引表 8 摘要 ．10 第一部分Cyfra21．1和SCC诊断食管鳞状细胞癌的临床意义 14 前言 ．16 材料和方法 ．17 一、材料 ．17 l、血清收集及准备 一17 2、主要试剂 17 3、主要仪器 17 二、方法 ．．17 1、ELISA检测血清Cyfra21．1和SCC浓度 17 2、化学发光法检测血清Cyfra21．1和SCC浓度 18 3、统计学处理 一18 结果 19 1、食管鳞癌和食管不典型增生及健康对照血清Cyfra21．1表达水平比较 19 2、食管鳞癌和食管不典型增生及健康对照血清SCC表达水平比较 ．20 3、食管鳞癌血清Cyfra21．1水平与临床病理参数比较 ．2l 4、食管鳞癌血清SCC水平与临床病理参数比较 ～22 5、联合检测血清Cyfra21．1和SCC水平对辅助ESCC诊断的比较 22 6、化学发光法定量检测血清Cyfra21．1和SCC表达水平 23 讨论 ．．：15 小结 31 第二部分用基于磁珠的MALDI．TOF．MS蛋白质组技术发现食管癌血清多肽标志物 32 前言 ．34 材料和方法 ．36 一、材料 ．36 1、血清收集及准备 一36 2、血清的采集、制备及存储 ．37 3、抗体 ．．37 4、主要仪器 37 5、主要试剂 38 6、常用溶液的配制 一38 二、方法 ．38 l、磁珠预处理血清 一38 2、芯片上样和肽谱生成 一38 3、训练集的构建 ．．39 4、nano．LC／ESI—MS／MS鉴定肽段标志物 39 5、免疫组织化学染色 ．．39 6、ELISA检测 ．40 7、化学发光法检测血清Cyfra21．1和SCC浓度 40 8、统计学处理 ．．41 结果 一42 1、质谱重复性和精确性检测 ．42 2、训练集样本检测及扫描发现差异峰 ．42 3、诊断模型的建立 ～44 3 万方数据 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 目录 4、诊断模型的验证 ．．47 5、诊断模型对不同TNM分期ESCC的诊断效果 ．48 6、诊断模型与Cyfra 21．1和SCC对比 49 7、差异多肽的蛋白鉴定 ．．5l 8、ESCC组织中TSPl过表达及与生存期的关系 ．．54 9、TSPl血清水平在ESCC患者中表达升高 一57 讨论 一59 ，J、结 ．．68 第三部分制备抗TSP 1多肽抗体及其在食管癌血清检测中的应用 69 前言 ．71 材料和方法 ．73 一、材料 ．73 l、实验动物 73 2、细胞系 73 3、主要仪器 73 4、主要试剂 73 5、常用溶液的配制 ．．74 二、方法 76 1、多肽合成及偶联 ．．76 2、多克隆抗体 ．．77 3、单克隆抗体 ．．78 4、统计学处理 ．．80 结果 ．8l 1、多肽免疫原性和偶联效率 ．8l 2、多克隆抗体血清滴度检测 ．8l 3、ESCC术前术后及健康对照样本血清评估多克隆抗体 82 4、筛选阳性杂交瘤细胞 一83 5、单克隆抗体相对灵敏度测定 ．87 6、单克隆抗体竞争抑制测定 ．87 7、ESCC术前和健康对照样本血清评估单克隆抗体 ．88 讨论 ．．89 小结 ．．9l 第四部分ABCC4在食管鳞癌顺铂耐药中的作用和增强子结合转录因子的鉴定 92 前言 ．94 材料和方法 ．96 一、材料 ．96 1、细胞系 96 2、菌株 96 3、引物 ．．96 4、抗1本 ．．96 5、主要仪器 97 6、主要试剂 97 7、常用溶液的配制 98 二、方法 ．99 l、细胞培养 99 2、细胞蛋白质的提取 ．．99 3、蛋白定量 99 4、Western blot analysis．．． ．．． ．．． ． ．． ． ． ． ．． ．． ． ． ． ． ． ． ． ．100 5、siIⅢA转染 101 6、MTT法检测顺铂敏感性 ．．101 7、质粒构建 ．101 4 万方数据 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 目录 8、质粒的小量提取 102 9、质粒鉴定 ： ．102 10、无内毒素质粒的大量提取 ．102 11、报告基因实验 ．．103 12、ChIP实验 103 13、PCR扩增 ．106 14、统计学处理 ．．106 结果 107 1、ABCC4表达水平与顺铂化疗敏感性的关系 107 2、敲降ABCC4对顺铂化疗敏感性的影响 107 3、ABCC4变异区段增强子转录调控功能检测 ．108 4、ABCC4变异区段结合转录因子检