课程设计思全路91.pptVIP

;;实 验 安 排 ;碱性磷酸酶的定点突变;反应体系 ddH2O X uL 2.5mmol/L dNTP 4uL 10xbuffer Mg2+Free 5uL 引物 （10umol/L） 2uL/each 模板DNA 1uL Ex－Taq E 0.3uL（1.5U）;PCR产物的回收(博大PCR产物快速胶回收试剂盒） 1. 切胶、称胶重,每100mg胶加入700uL溶胶液，550C溶胶(一定要完全溶解)。 2. 装柱，12000rpm离心30秒，去除废液。 3. 漂洗:500uL漂洗液，12000rpm,30秒漂洗一次，去除废液,重复漂洗一次。 4. 12000rpm,2分钟，换成干净的无菌1.5mL小管。 5. 向柱子的正中央加20uL洗脱buffer或无菌水，放置5分钟。 6. 12000rpm,30秒。 7.向柱子的正中央加10uL洗脱buffer或无菌水，放置5分钟。 8. 12000rpm,2分钟。 9. SYBR检测回收产物;质粒DNA的提取 接含pETBlue-2(质粒的单菌落于4mL LB 羧苄（50ug/mL ）和四环素（12.5ug/mL）液体培养基中 ? 370C，190rpm振荡培养过夜 ? 4000rpm、离心1min，收集所有菌体 ? 150uL溶液I悬浮菌体（旋涡混匀），室温10min ? 加入200uL溶液II（轻轻混匀!），室温静置菌液裂解变清 ;? 加入200uL溶液III（轻轻混匀!），冰上静置15min质粒DNA复性 ? 12000rpm，离心10min ? 上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（旋涡混匀） ? 12000rpm，离心5min ? 上清加等体积的氯仿：异戊醇（旋涡混匀） ? 12000rpm，离心5min ?;上清加2倍体积的无水乙醇（旋涡混匀），室温 30min ? 12000rpm，离心10min ? 沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（振荡混匀、离心） ? 12000rpm，离心5min ? 沉淀于超净台中风干 ? 沉淀加入20uL RTE，600C水浴30分钟溶解 ? -200C保存; 370C酶解3小时 酶切产物的纯化和回收(博大PCR产物快速胶回收试剂盒） 每100uL溶液加入700uL溶胶液，其余的操作步骤同前。 向柱子的正中央加20uL洗脱buffer，其余的操作步骤同前。 ;连 接 反 应 体 系（ 20 uL ）;感受态细胞的制备 1. 预培养：接DE3PlacI单菌落到含34ug/mL Cam的3mL LB培养基中，370C、190rpm振荡培养过夜 2. 取 0.4mL预培养菌液转移到含34ug/mL Cam的40mL LB液体培养基的锥形瓶中， 370C、250rpm振荡培养2.5-3小时（OD600 0.4-0.5） 3. 将菌液转移到50mL离心管中，冰上放置10min 4. 40C， 4000rpm ，离心10min 5. 到出培养液，将管倒置使培养液流尽 6. 菌体加入预冷的0.1 mol/L的CaCl2 10mL，用5 mL枪头轻轻吹散菌体细胞，冰浴30min;7. 40C， 4000rpm ，离心5min，去上清 8. 用冰预冷的0.1 mol/L的CaCl2 2mL用枪轻吹悬浮细胞，冰上操作 9. 分装细胞200uL/份，此为感受态细胞（也可于-700C或-200C冻存） 取200uL感受态细胞，加入连接产物10uL 取200uL感受态细胞，加入质粒DNA 2uL（5－50ng)（阳性对照） 取200uL感受态细胞，加入2uL无菌水（阴性对照） 取200uL 0.1 mol/L的CaCl2 ，加入连接产物2uL （阴性对照） 用枪头混匀，冰上放置30min;2. 420C水浴热激90秒 3. 冰浴2分钟 复苏 每管加800uL LB液体培养基，370C慢摇1小时（150rpm ） 选择性筛选 将复苏菌液4000r/min离心1min，先吸去900uL上清，再将细胞吹散 成细胞悬液，取50uL细胞悬液直接涂布在选择平板(50ug/mLCarb, 34ug/mL Cam, 40ug/mLBCIP)上，倒置培养过夜（370C）;表达与活性检测;单克隆抗体;动物免疫;1. 包被特异性抗原：将BSA用包被液稀释至2 ug/ml，每孔加入 100 ul， 37℃ 2小时； 2. 封闭：弃包被液，每孔加入200ul封闭液，37℃孵育1小时； 3. 加一抗：弃封闭液，甩干，每孔加入一抗(,PBS稀释液、阴性血清、 小鼠抗血清1:500,1000,2000,4000,8000,16000)100u