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第三章 基因工程载体 第一节 基因克隆技术概述 一、基因克隆技术 基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组的DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合 。 二、目的基因的取得 1、直接 2、反转录酶 3、化学合成 4、基因文库 5、PCR 首先利物理方法（如剪切力、超声波等）或酶化学方法（如限制性内切核酸酶）将生物细胞染色体DNA切割成为基因水平的许多片段，继而将这些片段与适当的载体结合。将重组DNA转入受体菌扩增，获得无性繁殖的基因文库，再结合筛选方法，从众多的转化子菌株中选出含有某一基因的菌株，从中将重组的DNA分离、回收。 这种方法也就是应用基因工程技术术分离目的基因，其特点是绕过直接分离基因的难关，在基因组DNA文库中筛选出目的基因。可以说这是利用“溜散弹射击”原理去“命中”某个基因。由于目的基因在整个基因组太小，在像当程度上还得靠“碰运气”，所以人们称这个方法为“鸟枪法”或“散弹枪”实验法。 面包酵母吲哚甘油磷酸脱氢酶基因的制取，先用EcoRI把面包酵母DNA切成许多片段，使这些片段与λ载体连成重组DNA，可把这些重组DNA导入“吲哚甘油磷酸脱氢酶型组氨酸缺陷型”大肠杆菌，在基本培养基中培养。只有引入了该基因的细菌才能生长。进一步分离这种菌株，可以得到目的基因。 三、重组体的构建 1、载体 要把一个有用的基因通过基因工程手段送进生物细胞中，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫载体（Vector）。 （1）质粒（plasmid) （2）噬菌体?的衍生物 （3）科斯质粒（cosmid） （4）单链DNA噬菌体M13 （5）病毒 2、载体的性质 1）它必须具有能够在某些宿主细胞中独立地自我复制和表达的能力。 2）载体DNA的分子量应该较小。 3）载体上最好应具有两个以上的容易检测的遗传标记（如抗药性基因等），以赋予宿主细胞以不同的表型。 4）载体应该具有多个限制性内切酶的单一切点；载体上的单一酶切位点最好是位于检测表型的遗传标记基因之内，这样目的基因是否已连接载体就可以通过这一表型的改变与否而得知，利于筛选重组体。 3、酶系的选用 四、转化及重组子筛选鉴定 1、转化（transformation) 获得重组DNA以后，必须将它导入宿主细胞中以扩增表达，这个导入宿主细胞的过程称为转化（transformation） 感受态（competence)、电击 2、重组子 3、重组子的筛选方法 （1）载体上的报告基因（reporter gene) 抗药性基因、lacZ基因的显色反应、发光基因（lux) （2）单菌落扩增 （3）菌落杂交 第二节 质 粒 载 体  （ Plasmid Vector) 一、质粒的概念 附加体（整合质粒，intergrative plasmid) 二、质粒的一般生物学特性 1、质粒DNA （1）SC构型： 共价闭合环形DNA (closed circle DNA,ccDNA) （2）OC构型 开环DNA(open circle DNA,ocDNA) （3）L型 线性DNA(linker DNA,lDNA) 质粒名称 质粒来源 核苷酸长度（kb） 分子量(MD) pTiAch5 土壤农杆菌 213 142 To L 假单胞菌 117 78 F 大肠杆菌 95 63 RP4 假单胞菌 54 36 Col E1 大肠杆菌 6.36 4.2 pBR322 大肠杆菌 4.362 2.9 pBR345 大肠杆菌 0.7 0.46 2、质粒的复制与遗传 根据质粒与宿主