磁珠分离DNA技术检测HIV-1逆转录酶基因耐药性突变-生物通.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（８）：１０５～１０９ 磁珠分离ＤＮＡ技术检测ＨＩＶ１逆转录酶基因 耐药性突变 ２，３ １ １ １ １ 程绍辉 　何红秋 　刘　斌 　陈慰祖 　王存新 （１北京工业大学生命科学与生物工程学院　北京　１０００２２　２天津疾病控制与预防中心　天津　３０００３１） （３天津市疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制所　天津　３０００１１） 摘要　ＨＩＶ１逆转录酶基因突变导致的耐药性严重影响了药物对病人的治疗效果，耐药性突变的 检测对于指导合理用药具有重要意义。发展了一种检测ＨＩＶ１逆转录酶基因耐药性突变的新方 法，在两步 ＭＳＰＣＲ方法的基础上，引入磁珠分离ＤＮＡ技术并结合酶联免疫吸附检测方法 （ＥＬＩＳＡ）检测逆转录酶基因耐药性突变Ｔ２１５Ｆ和Ｙ１８１Ｃ。结果显示：ＭＳＰＣＲ结合磁珠分离技术 和ＥＬＩＳＡ具有较高的灵敏度和特异性，阳性／阴性比值（Ｐ／Ｎ值）达到要求，突变型模板检测限为 ５％左右，耗时短且能进行高通量检测。无论在ＨＩＶ１耐药性突变还是其它的点突变检测中，该方 法都具有较好的临床应用前景。 关键词　逆转录酶　耐药性突变　磁珠　ＥＬＩＳＡ　ＭＳＰＣＲ 中图分类号　Ｑ８１９ 　　高效抗逆转录病毒治疗法（ｈｉｇｈｌｙａｃｔｉｖｅａｎｔｉ 不但影响药物对病人的治疗效果，而且使新感染者可 ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｔｈｅｒａｐｙ，ＨＡＡＲＴ）的推广使用，能够在一定程 能面临一经感染就无药可治的局面。因此，应当在治 度 上 控 制 由 人 类 免 疫 缺 陷 病 毒 （ｈｕｍａｎ 疗过程中定期监控以减少耐药突变的产生与传播。这 ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｖｉｒｕｓ，ＨＩＶ）引起的人类获得性免疫缺 就要求有一系列操作简单、灵敏度和特异性较高的可 陷综合症（ａｃｑｕｉｒｅｄｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＡＩＤＳ） 靠的耐药性检测方法。 ［１，２］ 　　ＨＩＶ１耐药性检测方法分为基因型检测方法和表 的感染和传播 。但是，随着各种抗逆转录病毒药物 的使用，ＨＩＶ耐药突变毒株不断出现并广泛传播，严重 型检测方法，基因型检测具有可提供交叉耐药资料、所 ［３，４］ 需的时间短（几天或几小时）、技术步骤少、费用较低等 影响了ＨＡＡＲＴ的治疗效果 。耐药性突变通常以字 母数字字母的方式表达，第一个字母代表野生型病毒 优点，主要包括 ＤＮＡ序列分析法和分子杂交分析 ［５］ 氨基酸残基，数字代表该残基在蛋白质中的位置，第二 法 。基于ＲＴＰＣＲ扩增后的ＤＮＡ测序方法被称为 ［６］ ［３］ ＨＩＶ耐药性临床检测中的黄金标准 ，该方法准确性 个字母代表突变型病毒氨基酸残基 。例如：Ｙ１８１Ｃ 表示病毒第 １８１位的氨基酸残基由野生型的酪氨酸 高，但对野生型和突变型混和毒株的检测时灵敏度较 （Ｔｙｒ，Ｙ）突变为亮氨酸（Ｃｙｓ，Ｃ），下文中的突变均以 低，而且成本较高。其它的基因型检测法如基因芯片 ［７］ 该方法表示。近年来，我国已经开始开展了对艾滋病 技术则受到灵敏度较低的限制 。 患者的大规模 ＨＡＡＲＴ治疗，随着药物的广泛使用，耐 　　突变分离的 ＰＣＲ（ｍｕｔａｇｅｎｉｃａｌｌｙｓｅｐａｒａｔｅｄＰＣＲ， ［８］