第十八章好高效液相色谱法.pptVIP

第一节 高效液相色谱法的主要类型和原理 一、主要类型 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC） 化学键合相色谱法(BPC) 一、液固吸附色谱（LSC） 2.固定相 二、化学键合相色谱法 以化学键合相为固定相的色谱法，简称键合相色谱法(bonded phase chromatography；BPC) 化学键合相：采用化学反应的方法将官能团键合在载体表面所形成的固定相 . 化学键合相优点 （一）正相键合相色谱法 1.固定相：极性键合相 如氰基（－CN）、氨基（－NH2）或二羟基键合硅胶。 2.流动相：非极性或弱极性溶剂加极性调整剂 3.适用范围：溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物 4.分离机制 分配：把有机键合层作为一个液膜看待，溶质在两相的溶解 吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和定向作用 5.分离选择性： 极性强的组分k大，后洗脱出柱,tR 增大。 流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分k减小，tR 减小。 （二）反相键合相色谱法 1.固定相：非极性键合相 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）键合硅胶 2.流动相：水+与水混溶的极性调整剂 常用甲醇－水、乙腈－水等 5.保留行为的主要影响因素 (1)、溶质的分子结构（极性） 极性越弱，疏水性越强，k越大，tR也越大。 同系物碳数越多，极性越弱，k越大； 引入极性取代基，降低疏水性，k值变小。 (2)、固定相 键合烷基的疏水性随碳链的延长而增加，溶质的k也增大。 硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶质的k越大。 (3)、流动相 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大 1)溶剂比例：水的比例增加，使k增大 2)pH：影响弱酸、弱碱的离解 流动相的pH降低，弱酸k增大，tR增大；弱碱k变小。 离子抑制色谱法（ion suppression chromatography；ISC ） 用少量弱酸、弱碱或缓冲溶液，调节流动相的pH，抑制有机弱酸、弱碱的离解，增加疏水缔合作用，使k变大。 适用于3≤pKa≤7的弱酸、7≤pKa≤8的弱碱 3.离子对模型 4.影响组分保留行为的因素 (1)离子对试剂的种类和浓度：碳链长度增加，溶质的k增大；在一定范围内试剂的浓度升高，溶质的k增大 (2)流动相的pH：有利于组分和离子对试剂离子化时（离子对的形成），组分的k值最大 第二节　高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择 （一）键合相的种类 1.非极性键合相 ： 1.非极性键合相 ： 2.弱极性键合相： 醚基和二羟基等键合相 用于反相或正相色谱 3.极性键合相： 常用氨基﹑氰基键合硅胶(氨基柱、氰基柱） 一般用于正相色谱 （二）键合相的特点 （1）使用过程中不流失； （2）化学稳定性好； （3）适于梯度洗脱； （3）载样量大 二、化学键合相色谱法的流动相 （自学） 对流动相的要求： 与固定相不发生化学反应。 对试样有适宜的溶解度。使k在1~10范围内， 与检测器相适应。 纯度高，粘度小。低粘度流动相如甲醇﹑乙腈等可以降低柱压，提高柱效。 三、分离条件的选择 （一）HPLC中的速率理论 1.涡流扩散　A=2λdp 球形、小粒度、均匀（RSD＜5%）固定相，匀浆高压填充，以降低A。 2.纵向扩散　B=2γDm 可以忽略。 因为Dl很小，室温操作，且U大于U最佳， （二）影响分离的因素 n由色谱柱（固定相）性能决定， α主要受溶剂种类的影响， k受溶剂配比的影响。 第三节　高效液相色谱仪 组成 输液系统 进样系统 色谱柱系统 检测系统 数据记录处理系统 一、输液系统 1.高压输液泵 恒流泵：在输送流动相过程中流量恒定。常用柱塞往复泵 (二)输液泵应具备的性能： 1.流量精度高且稳定 2.流量范围宽 3.能在高压下连续工作 3.液缸容积小 4.密封性能好，耐腐蚀 (三)输液泵操作注意事项： 1.防止固体微粒进入泵体 2.流动相不应含有腐蚀性物质 3.防止溶剂瓶内的流动相被用完 4.不超过规定的最高压力 5.流动相一般应该先脱气 二、分离和进样系统 (一)进样器 进样阀 （六通阀） 三、检测系统 （一）检测器(detector)的主要性能 1.要求： (1)灵敏度（sensitivity）高（检测限低） (2)噪音（noise）低 (3)线性范围（linear range）宽 (4)重复性（repeatability）好 (5)适用范围广（通用型、专属型） （二）紫外检测器(ultraviolet detector) 1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer