流式细胞心仪分析.ppt

检验本科 流式细胞仪分析 技术及应用 第一节 流式细胞仪的分析及 分选原理 一、工作原理㈠ 基本组成结构 ㈡ 基本工作原理 二、散射光的测定 ㈠ 前向散射光（FS） ㈡ 侧向散射光（SS） 三、荧光测量 四、细胞分选原理㈠ 基本原理 ㈡ 技术要求 第二节 数据的显示与分析 第三节 流式细胞仪免疫 分析的技术要求一、免疫检测样品制备 二、免疫分析中常用的 荧光染料与标记染色㈠ 常用的荧光染料 ㈡ 免疫荧光标记 ㈢ 细胞自发荧光 三、流式细胞免疫学技术的质量控制㈠ 单细胞悬液制备的质量控制 ㈡ 细胞悬液免疫荧光染色的质量控制 ㈢ 仪器操作技术的质量控制 ㈣ 免疫检测的质量控制 第四节 流式细胞术在免疫学 检查中的应用 图1 流式细胞仪 图2 流式细胞仪 图3 流式细胞仪 图4 流式细胞流动池模拟图 图5 FCM工作原理流程图 图6 前向散射光示意图 图7 侧向散射光示意图 图8 4色荧光峰形线图 图9 细胞分选原理 图10 流式细胞仪工作原理 图11 前向散射原理图 图12 侧向散射原理图 图13 流式细胞仪中滤片的位置 图14 液滴形成过程 1、同型对照：为免疫荧光标记中的阴性对照。由于荧光标记单抗的组织来源不同，应选用相同来源的未标记单抗作为同型对照来调整及设置电流电压，在此基础上进行样本检测可使荧光标记单抗的信号保持特异性，如不用同型对照，结果的可靠性将受到影响。 2、全程质控 质控物Immuno-Trol Cells是全血质控的冻干品，将其复溶后与待检标本一起标记、洗涤和检测，所得结果如达标定靶值，提示本次实验结果可靠。 一、淋巴细胞及其亚群的分析 二、淋巴细胞功能分析 三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型 四、肿瘤耐药基因分析 五、在AIDS病检测中的分析 六、自身免疫性疾病相关HLA抗原分析 掌握：⑴ 流式细胞仪的工作原理； ⑵ 流式细胞仪的技术要点 熟悉：流式细胞术在免疫学检查中的应用 了解：流式细胞仪的数据显示与分析 前向散射光 鞘液 喷嘴 侧向荧光信号 鞘液 分光镜 红色荧光 绿色荧光 90°散射光 前向散射光 激光器 细胞收集管 细胞悬液 电荷环 偏转板 废液 大颗粒 小颗粒 激光器 激光器 激光探测器 复杂性颗粒 简单性颗粒 侧向散射光探测器 激光器 激光器 FITC RD1 ECD PC5 荧光波长（nm） 荧光强度 3、细胞分选 2、细胞膜、胞质、胞核着色 1、细胞悬液 4、细胞培养、研究 喷嘴 激光 喷嘴 压电晶体 分色反光镜 阻断滤片 偏转板 － ＋ 废液抽吸 前向散射光检测器 激光器 样品 鞘液 液滴形成信号 液滴充电信号 F1 PMT F2 PMT F1 F2 散射 * * 流式细胞术（FCM）——是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。（图1、2、3） 流式细胞仪由液流系统、光学与信号转换测试系统和信号处理及放大的计算机系统三大基本结构组成。 流式细胞术所具有的分析和分选功能主要涉及光学原理、光电转换原理和测试原理三部分。 1、液流系统：由样本和鞘液组成。 样本：待测细胞被制备成单个细胞的悬液后经荧光染料标记的单克隆抗体染色； 鞘液：是辅助样本流被正常检测的基质液。作用（图4） 2、光学系统：由激光光源、分光镜、光束成形器、透镜组和光电倍增管组成。 ⑴ 激光光源：多为气冷式氩离子激光器，其激光束波长为488nm，15mW。 ⑵ 分色反光镜：反射较长波长的光，通过较短波长的光。 ⑶ 光束成形器：将激光器发射的激光束聚焦成高15μm、宽57μm的椭圆光斑。 ⑷ 透镜组：将激光和荧光变成平行光，同时除去离散的室内光。 ⑸ 滤片：长通滤片一允许长于设定波长的光通过；短通滤片一允许短于设定波长的光通过；带通滤片一允许一定带宽波长的光通过，其他波长的光不能通过。 ⑹ 光电倍增管：检测荧光和散射光，同时将光学信号转换成电脉冲（数字数据）信号。（图13） 3、数据处理系统： 主要由计算机及其软件组成。 标志了特异性荧光染料的单细胞悬液经喷嘴高速射下，与水平方向的高度聚焦的激光束垂直相交，单个细胞上标记的荧光染料在通过激光光