流式细胞仪分析悦技术及应用.ppt

(二)双参数数据的显示 Two-Parameter Data Displays 细胞双参数测定不仅能提供二个参数各自与细胞 数量的关系，更重要的是获得了这二个参数之间的相关关系，其中包含了更多的生物学信息。双参数数据显示最常用的是二维的散点图( Dot Plot )。在二维图上，横轴代表第一个测量参数，纵轴代表第二个测量参数。 纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量 参数,在图中每一个点代表一个细胞 1 、点图 用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相 同，不同的等高线上细胞数不同。 2 、二维等高图 纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数,Z轴为细胞数。 3 、假三维等高图 三维坐标匀为参数（散射光或荧光）而非细胞数。 (三) 三参数直方图 一般利用所得参数的两两组合并利用设门（Gate) 技术，来分析参数之间的相互关系。 （四）流式细胞仪的多参数分析 1 、Region设置 2 、 设置 Gate 样品制备：单细胞悬液 特定荧光染料的选择：光谱重叠 阴性对照的设置:检测标本的重复性 质量控制 第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求 细胞碎片 细胞团块 离心漂洗 固定剂 一、免疫检测样品制备 淋巴细胞分离液分离外周血中单个核细胞。 Ficoll,40kd，高密度，低渗透压，无毒性。 （比重为1.0177±0.001的分层液). （一）外周血淋巴细胞样品的制备 利用红细胞裂解液去除红细胞后，得到外周血 中所有白细胞的流式细胞分析的二维散色光点图 单层培养细胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法 使细胞从培养皿上消化下来，然后离心漂洗。 悬浮培养细胞，可不用酶消化，直接吹打制备 成单细胞悬液。 （二) 培养细胞的样品制备 机械法：剪碎法、网搓法、研磨法。 酶处理法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶等。 化学试剂处理法：EDTA、EGTA等。 表面活性剂处理法： Triton-100、皂素等。 (三)新鲜实体组织单细胞悬液的制备 机械法往往常成严重的细胞损伤，而结果却是较低的细胞产量。 如用低速离心去碎片，用尼龙网过滤团块等， 也可利用电子学技术处理的方法排除团块和碎片 的干扰。 酶学法、化学法对实体组织的分散效果较理想，但会造成所测化学成份的不良影响。FCM所测细胞是单个分散状态；对细胞团块，细胞碎片尽可能 少；细胞的活性不受损害，以保证下一步的荧光 染色处理不受影响。 防止细胞自溶，保持细胞膜原有的特性保存的方法： 1、深低温保存法：深低温冰箱，保存一年。 2、乙醇与甲醇保存法：70%冷乙醇、75%的甲醇。 3、甲醛或多聚甲醛固定法：细胞不具有生物活性，但 细胞表面荧光染色分析不受影响。 (四）单细胞悬液的保存 染料的选择和标记染色保证了荧光信号的产生 （一）免疫荧光标记最常用的荧光染料 荧光染料 激发波长（nm) 发射波长（nm) 颜色 FITC 488 525 深蓝色 PE(RDI) 488 575 橙色 ECD 488 620 橙红色 PeCy-5 488 670 红色 PeCy-7 488 755 深红色 PI 488 620 橙红色 APC 633 670 红色 FITC 488 525