水稻叶片高质量DNA抽提-Bio-protocol.PDF

/e1010102 DOI:10.21769/BioProtoc.1010102 水稻叶片高质量DNA 抽提 High-quality DNA Extraction from Rice Leaves 吴昊，陈太钰，林拥军，陈浩* 作物遗传改良国家重点实验室，华中农业大学，武汉 *通讯作者邮箱：hchen@ 引用格式：吴昊，陈太钰，林拥军，陈浩. (2018). 水稻叶片高质量DNA 抽提. Bio-101 e1010102. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010102. How to cite: Wu, H., Chen, T. Y., Lin, Y. J. and Chen, H. (2018). High-quality DNA extraction from rice leaves. Bio- 101 e1010102. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010102. (in Chinese) 实验原理：植物体内的 DNA 通常在细胞核中以核蛋白的形式存在，利用阳离子去垢剂 CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵) 与剧烈的高 低温差破坏细胞膜结构使这些核蛋白释放出来。利用氯仿等有机试剂去除蛋白、多糖、 酚类等杂质，且DNA 在高盐 (1 M NaCl 溶液) 条件下可溶，最后使用高浓度酒精溶液 重新沉淀获得高质量的植物基因组DNA。 实验目的：大量提取植物基因组DNA，可用于Southern blot 分析，对转基因植株进行 外源基因插入拷贝数和整合模式检测等。 关键词：总DNA，大样抽提，Southern blot 材料与试剂 1. 10 ml 离心管 2. 水稻叶片 3. CTAB 粉末 (Bio Basic Inc. GB0308BJ011J) 4. Tris-HCl, pH 8.0 (进口分装) 5. EDTA, pH 8.0 (国药) 6. NaCl (国药集团有限公司，分析纯) 7. 异戊醇 8. 液氮 9. 氯仿/异戊醇 (24:1) Copyright © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 1 /e1010102 DOI:10.21769/BioProtoc.1010102 10. 10% CTAB 11. RNase 12. 75%乙醇 13. 琼脂糖 14. 1.5х CTAB (见溶液配方) 15. 10% CTAB (见溶液配方) 16. 1% CTAB (见溶液配方) 17. 氯仿/异戊醇24:1(体积比) (见溶液配方) 18. 1 M NaCl 溶液 (见溶液配方) 19. TE buffer (见溶液配方) 仪器设备 1. 水浴锅 2. 通风橱 3. 离心机 实验步骤 1. 取1 g 生长旺盛的水稻植株叶片，于液氮中迅速研磨成粉。 注意：请用冰盒取样，如不能立即抽提可保存于-20 °C。建议取样后尽快抽提，避 免样品DNA 降解。将粉末转移至 10 ml 离心管中，加入2 ml (枪头需提前划好刻 度以免因受热后吸取过量)煮沸的 1.5х CTAB (保持高温) 。 2. 65 °C 温浴30 min 。 3. 检查样品顺序，在通风橱内加入等体积 (氯仿腐蚀性很强且易挥发，对移液器损害 很大，可使用玻璃滴管) 的氯仿/异戊醇 (V/V=24 :1)，盖紧管盖，仔细检查保证每 个离心管不漏液，轻缓颠倒混匀25 min，3,000 rpm 离心15 min。 4. 打开管盖，转移上清液于另一10 ml 离心管中，加入1/10 体积 (约200μl) 的10% CTAB (提前于65 °C 温浴)，再加入等体积的氯仿/异戊醇 (V/V=24 :1)，轻缓颠倒 混匀20 min，3,000 rpm 离心15 min。 5. 用移液器吸上清 (如果使用1 ml 的枪头，需提前剪去大约7 mm 的枪尖，吸取上清 Copyright © 2018 The Authors