第五章植物细胞培养及原载生质体培养.pptVIP

（4）．细胞悬浮培养: 培养基为含l mg/l 2,4-D、0.05mg/l KT及l0％椰乳的MS培养基pH5.8。l00ml三角瓶的培养基装量为25ml，高压灭菌20min冷却后按1-2g/L干重接种愈伤组织．愈伤组织切成干重1mg 小块。于25℃摇床中以120转／分钟 振荡培养30天，即得三七悬浮细胞培养物。 （5）三七细胞大量培养：培养基与悬浮细胞培养相同。在l0L搅拌反应器中加入培养液，培养液充满系数为0.75一0.80，灭菌后冷却至室温．接种已培养25—30天的悬浮培养细胞，接种量按干细胞计为1—2g/L，在25—26℃下，以60转／分钟搅拌速度及0．6vvm—o．8vvm(vvm为每分钟单位体积培养液中通入空气的体积数)速度通气，并维持pH5.5—5.8．培养30天，收获细胞。 （6）细胞收集及干燥： 每批细胞培养30天后，离心或过滤收集细胞，用去离子水洗涤3次，每次抽干，然后于30一40℃低温下真空干燥或冻干，即得三七培养细胞成品。 二、原生质体培养技术： 通过一定方法除去细胞壁，而得到一个裸露的植物细胞，即为原生质体(Protoplast)。游离的原生质体在一定条件下培养可以重新形成细胞壁，并像正常的植物细胞那样具有全能性，经过适当的培养可以再生出完整植株。 A-E, 培养的欧当归(Levisticum officinale Koch))原生质体分裂再生成植株的过程 F-L, 培养过程的核变化；F.多核，G.核穿壁，H.无丝分裂，I.染色体桥，J. 2n=22，K.L.多倍体. A-D当归(Angelica sinensis(Oliv) Diels)原生质体培养成再生苗 E-H,红豆草(Onobrychis vicaefolia Scop) )原生质体培养再生植株 原生质体培养的目的： （1）利用原生质体不具细胞壁的特性可以进行细胞器移植和外源物的摄取(病毒、微生物、外源遗传物质)，原生质体之间可以进行融合而产生杂种细胞(即体细胞杂交）。 （2）是植物基因工程的理想受体，用外源遗传物质对植物原生质体进行改造和转化，然后诱导分裂、分化再生出能育的完整基因工程植株。 （3）也是研究细胞生物学、分子生物学、体细胞无性系变异和植物病理学研究的有用工具。 自1970年首次获得原生质体再生植株成功以来，通过原生质体获得再生植株的植物约有280余种，其中有20种为我国首先报道。 原生质体培养包括原生质体的分离、培养、植株再生等过程。 (一) 原生质体的制备： 1、材料来源与预处理： （1）材料来源： 可以用各种组织和器官，但多应用叶片、愈伤组织及悬浮培养细胞。以及茎尖、根尖、子叶和胚性组织。 （2）预处理： A.预质壁分离：17-20 ℃ 酶液中静置半小时，再于28—34℃保温，或将材料置于与酶液中糖浓度相同的溶液中预培养1h左右，再浸于酶液中消化即可达到质壁分离目的； B. 预培养: 将除去下表皮的叶片于诱导愈伤组织培养基上培养7天，再用酶消化去壁，所得原生质体分裂频率较高； C. 暗处理: 将室温下生长5—7个星期的植物材料在黑暗中放置30h以上，取其叶片制备的原生质体有活力； D.光处理: 将叶片于日光或灯光下照射2—6h令其萎蔫，利于撕除下表皮及原生质体分离； E.低温处理: 夏季应用的实验材料其萌动种子应于4℃过夜后再播种，从其植株叶片上分离的原生质体培养效果较佳。 2. 制备原生质体的酶类： 高等植物细胞壁主要成分为a-纤维素，其次为半纤维素、果胶质及蛋白质。细胞生长的不同阶段及不同物种的细胞壁组成与结构不同，木质化及次生加厚的细胞壁不被酶消化，故选择消化细胞壁的酶类是制备原生质体关键。 常用的酶类有： A. 纤维素酶，如Onozuka R—10及RS，国内常用的为EA3—867，其中含少量果胶酶； B. 果胶酶，如Macerozyme R—10 又叫离析酶，主要含果胶酶，活力较高，其含杂酶较多，用量不超过2％，作用时间长有毒害作用；此外亦用Pectalyase Y—23，也叫离析软化酶，活力极高，叶片用量一般为0．1％，悬浮细胞为0．05％； C. 崩溃酶（Driselase)，为一种粗酶制剂，具有纤维素酶及果胶酶活性； D. 半纤维素酶，如Rhozyme HP150，用于悬浮细胞、豆科根瘤、幼苗子叶及根细胞原生质体的分离; E 蜗牛酶，主要用于体细胞原生质体分离。 * * 第 十 章 植物细胞及原生质体培养 一、植物细胞培养： 在一定条件下，通过人工供给营养物质及生长因子，使离体植物细胞生长繁殖的方法。 细胞培养技术主要用于研究细胞