第二十六章 基因工程药物.pptVIP

现在可以利用基因工程技术在大肠杆菌中表达、发酵来生产干扰素。 1.基因工程菌的组建 组建过程：分离干扰素mRNA，以mRNA为模板反转录合成cDNA，将cDNA克隆到载体中并转化大肠杆菌K12，获得干扰素基因工程菌。 所克隆的干扰素cDNA是从抗病毒活性最高的12SmRNA区域合成的。 克隆载体pBR322质粒，含有四环素和氨苄青霉素抗性基因。 重组人干扰素产品 第二十六章 基因工程药物 基因工程药物概论 基因工程药物含义 基因工程药物是指采用基因工程技术研制的，能预防和治疗某种疾病但含量极微而难以用传统方法制取的特殊药物。 一、基因工程药物种类 蛋白 细胞因子药物 蛋白类激素 溶血栓药物 治疗用酶 可溶性受体和黏附分子 其它 核酸 DNA药物 反义RNA药物 RNAi药物 核酶 重组蛋白质类药物 细胞因子药物：干扰素、集落因子、白细胞介素、肿瘤坏死因子、趋化因子、生长因子、凝血因子 蛋白质类激素药物：生长激素、胰岛素、胰岛素样生长因子、促卵泡素、甲状旁腺素、降钙素、胰高血糖素、促黄体生成素、甲状腺刺激素和心钠素等。 溶血栓药物：组织型纤溶酶激活剂、尿激酶型纤溶原激活物、蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂、链激酶和葡激酶等。 治疗用酶：超氧化物歧化酶、羧肽酶、尿酸氧化酶、葡糖脑苷脂酶、脱氧核糖核酸酶和胸苷激酶等。 可溶性受体和黏附分子：可溶性补体受体Ⅰ型 其他：血红蛋白、白蛋白等。 核酸类药物 核酸类药物主要是在核酸水平(DNA和RNA)上发挥作用，它通过纠正突变的基因并使之重新获得适当的功能来治疗或预防疾病。 特点是：能将基因表达的产物的作用局限于病变组织周围，从而使治疗更具针对性；只要转化细胞不被清除，转化的式因不被抑制，基因表达的产物就可以持续发挥作用。 基因工程药物的特点 从根本上解决了某些药物的生物原料 适应证不断延伸 技术含量高 加速疑难病症新药物的开发 二、研制基因工程药物的关键技术 确定研制基因工程药物的技术路线 基本技术路线1：获得具有预防和治疗作用的蛋白质的基因? 组入表达载体? 受体细胞高效表达? 动物试验? 临床试验? 申报新药证书 基本技术路线2：基因组?未知功能的人类基因全长cDNA群?组入表达载体?受体细胞瞬间表达?功能初筛?功能验证?重组蛋白表达?体内外药效分析?临床前研究?临床验证?申报新药证书 优点：目的明确。缺点：发现新药的机率低，在人体内表达量较高的蛋白质才有较大可能被开发。 建立在庞大人类基因资源基础上的，具有巨大的开发潜力，缩短新药开发的时间，可大规模增加新药的数量。 目的基因 基因载体 重组体 分 切 接 转 筛 表 总体技术路线 基因工程的操作流程 1、分：分离目的基因 2、切：对目的基因和载体适当切割 3、接：目的基因与载体连接 4、转：重组DNA转入受体细胞 5、筛：筛选出含有重组体的受体细胞 6、表：目的基因在受体细胞中表达，受体细胞成长为基因改造生物 基因工程制药的基本过程 获得目的基因↓构建重组质粒↓组建基因工程细胞↓工程菌培养↓产物分离纯化 Free template from * 三、 基因工程制药实例 人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor，GMCSF）是一个具有多项潜能的造血生长因子，它不仅能够促进造血前体细胞的增殖、分化和成熟，而且对其它的细胞，如抗原递呈细胞、成纤维细胞、角质细胞、皮肤粘膜细胞等，均有着不同程度的刺激作用。 GMCSF对某些疾病，如肿瘤患者放疗、化疗以后的白细胞减少症、再生障碍性贫血和骨髓移植的治疗有重要作用，以及在抗病素、抗真菌感染等的治疗中也有良好的疗效。 1985年Sieff等发表了第一篇有关重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的文章后，这些年来有关rhGMCSF研究报道的文献每年均在千篇左右。 GMCSF是糖蛋白，相对分子质量为22000，基因定位在第5条染色体长臂上，基因约2.5kb，含有4个外显子和3个内含子。其mRNA包括编码成熟蛋白质的127个氨基酸残基和信号肽的17个氨基酸残基的密码子。 重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子产品 1. 人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的制备 利用表达分泌型GMCSF工程菌W3100/ pGMCSF可以表达具有天然结构和生物活性的GMCSF，表达量高，易于纯化，无需复性，纯化的GMCSF比活高于包含体型，但其发酵表达技术较难掌握。 分泌型GMCSF工菌型W3100/pGMCSF发酵工艺 发酵 甘油保存菌划平皿，挑取单菌落，接种于LB种子培养基中，18h，再扩大培养12h，接种于30L发酵罐，30℃培养，过程中流加50%的葡萄糖、酵母浸出液及酷素水解物。 培养