第05章-代谢物酶法分析技术.pptVIP

* 酶活性恢复法 很多酶必需某些无机离子、微量元素或辅酶存在才发挥其催化活性。脱去酶中关键的无机离子、微量元素或辅酶之后，酶即失去了其催化活性，无活性的酶与标本混合，标本中的无机离子、微量元素或辅酶使该酶重新复活，复活的比例可以反映这些无机离子、微量元素或辅酶的含量。 其他酶法 (4) * 异柠檬酸脱氢酶法测定血清镁离子 酶活性恢复法 异柠檬酸+ NADP+ α-酮成二酸 + CO2 + NADPH+H+ 用EDTA和乙二醇二乙醚二胺四乙酸(GEDTA) 抑制钙离子，标本中Mg2+通过恢复ICD 活性，催化异柠檬酸脱氢的正向反应，使NADP+还原，与镁标准一起在340nm测定吸光度的増加。 * 酶活性恢复法应用举例 丙酮酸激酶法或色氨酸酶法测定钾离子 α-半乳糖苷酶法测定钠离子 淀粉酶法测定氯离子 超氧化物歧化酶法测定铜离子 碳酸酐酶或碱性磷酸酶法测定锌离子等 * 激活和抑制法 有机磷是乙酰胆碱酯酶的抑制剂，用标准乙酰胆碱酯酶与标本在37℃水浴10min，测定剩余的乙酰胆碱酯酶的活性，被抑制的乙酰胆碱酯酶的活性可以计算出标本中有机磷的含量。 有机磷的酶法测定 根据酶有否激活剂和抑制剂存在时酶促反应动力学发生改变来测定激活剂和抑制剂的含量。 另有抑制ALP法测定茶碱、激活HK法测定镁离子等。 返回章目录 * 试剂酶质量 试剂酶概念 试剂酶特征 试剂酶纯度 酶法设计要求 酶法设计共性要求 平衡法设计的要求 速率法设计的要求 代谢物酶法分析的设计要求 3 试剂酶来源 * 试剂酶是指作为诊断试剂来测定化合物浓度或酶活性的一类酶。它是酶试剂的核心，它的质量是酶试剂质量的决定性因素。 试剂酶的质量要求 (1) 试剂酶的概念 * 主要来自动植物组织提取及微生物发酵工程。基因重组酶蛋白也有应用，活力高，杂酶含量少且价格低廉。 不同来源的同一种试剂酶有不同的理化特征。必须掌握专一性和分子量、等电点、Km、最适pH，最适温度等，并熟悉辅助因子、激活剂和抑制剂对酶活性的影响。 试剂酶的来源和理化特征 试剂酶的质量要求 (1) * 不同的酶试剂系统对试剂酶的纯度有不同的要求。以NAD(P)H为指示反应中，要求试剂酶有较高的纯度。而在Trinder反应中要求相对低一些。 纯度主要指标 ①酶的比活性，酶的比活性越高，酶的纯度越高。②杂酶含量，容易引起副反应的一些酶含量按 “允许限度”的要求（见表5-2）。 试剂酶的质量要求 (1) 试剂酶的纯度要求 * 表5-2常用试剂酶的理化特征及质量要求 名称 来源 分子量 等电点 比活性 (U/mg) 杂酶占试剂酶活性的%（允许限度） 葡萄糖氧化酶（GOD） A.niger p.notatum 186000 152000 4.30 ＞20 蔗糖酶含量＜0.01%,过氧化氢酶＜10U/mg蛋白 己糖激酶(HK) 酵母 105000 4.50-4.80 ＞140 磷酸葡萄糖异构酶＜0.01%,G-6-P脱氢酶＜0.01% 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PDH) 酵母 212000 4.50 ＞140 己糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶＜0.02% 过氧化物酶(POD) 辣根 40200 7.20 ＞50 不含胺氧化酶及过氧化氢酶 * 名称 来源 分子量 等电点 比活性 (U/mg) 杂酶占试剂酶活性的%（允许限度） 脲酶 巨豆 483 000 4.90 5-100 天冬氨酸酶≤0.02%,精氨酸酶≤0.002%, NH4+≤0.0005μg/U, 谷氨酸脱氢酶(GLDH) 变形杆菌 300 000 4.60 ≥90 醇脱氢酶、乳酶脱氢酶、苹果酸脱氢酶＜0.01% 乳酸脱氢酶 心 135 000 4.5-4.8 ≥500 丙氨酸转氨酶＜0.01%,丙酮酸激酶、醛缩酶＜0.001% 脂蛋白脂肪酶（LPL） 心，假单胞菌属 47 000 5.95± 0.05 ＞100 ATP酶＜0.00008%, NADH氧化酶＜0.001%,胆固醇氧化酶＜0.002%,过氧化氢酶＜0.02% 甘油激酶（GK) 嗜热脂肪芽胞杆菌 209 000 ? ≥85 NADH氧化酶＜0.01%,己糖激酶＜0.02% * 名称 来源 分子量 等电点 比活性 (U/mg) 杂酶占试剂酶活性的% （允许限度） 磷酸-3-甘油氧化酶 足球菌 76 000 4.6±0.1 ＞40 乳酸氧化酶≤0.001% 胆固醇酯酶(CEH) 假单胞菌 302000 ? ＞25 ATP酶＜0.00008, NADH氧化酶＜0.001%,GOD＜0.00001%,尿酸酶＜0.00004%,过氧化氢酶＜1U/mg 胆固醇氧化酶(CHOD) 链霉菌 34000 5.1-5.4 ＞25 CEH＜0.005%,GOD＜0.00014%尿酸酶＜0.0