两栖类官抗菌肽temporin.docxVIP

辽宁师范大学硕士学位论文摘 辽宁师范大学硕士学位论文 摘 要 抗菌肽是天然免疫中的一种重要介质，是生物体在抵御病原微生物的防御反应过程 中所产生的一类具有抗菌抗癌等生物活性的多肽。本论文中，Temporin．1CEa是从中国 林蛙皮肤分泌物中提取出来的抗菌肽，由17个氨基酸组成，分子净电荷为+3，呈两亲 性的0【．螺旋结构，具有较好的抗癌活性。 本论文主要探讨了抗菌肽Temporin．1CEa对人乳腺癌MCF．7、MDA．MB．23l、 Bcap．37细胞的生物学效应和可能的作用机制。为此，我们首先通过MTT方法测定了 Temporin-1CEa对包括3种乳腺癌在内的12种肿瘤细胞增殖的抑制作用；然后选取人乳 腺癌MCF一7、MDA-MB-231和Bcap．37细胞进行作用机制的研究：通过乳酸脱氢酶 (1actate dehydrogenase，LDH)法和Annexin V／PI双染法检测了Temporin一1CEa诱导乳 腺癌细胞死亡的方式。在研究Temporin．1CEa对癌细胞膜的作用时，分别采用荧光探针 DiBAC4(3)和CalceinAm／EthD．1对肿瘤细胞的膜电位，膜损伤程度及膜通透性进行考察； 并通过荧光探针Rhodaminel23、Flu03．AM，分析Temporin．1CEa作用于乳腺癌细胞后 线粒体膜电位以及细胞内钙离子浓度的的变化情况。 结果显示：两栖类皮肤活性肽Temporin．1CEa分别作用于12种肿瘤细胞1h、6h、 24h、48h后，大部分癌细胞在1h左右开始出现死亡，并与剂量呈正相关性，而正常的 细胞则没有出现明显的死亡和生长抑制现象。因此，本论文主要选取3种不同的乳腺癌 细胞作为进一步的研究对象，探讨Temporin．1CEa的作用机制。 进一步研究结果显示，Temporin．1CEa以生物膜为主要作用靶点，首先使乳腺癌细 胞细胞膜的膜电位升高，通透性增加。其进入细胞后，该肽可以使线粒体膜电位下降， 损伤线粒体膜，使线粒体无法正常供给细胞能量；此外，细胞内游离钙离子浓度升高也 可能参与了Temporin．1CEa引起的乳腺癌细胞毒性反应。 关键词：抗菌肽；乳腺癌细胞；抗癌机制 Research Research of amphibian antimicrobiol peptides Temporin-1 CEa on the anticancer mechanisms of breast cancer cells Abstract Amphibian antimicrobial peptides as important mediators of innate immunity of living organisms．iS a class of peptides with antimicrobial and anticancer activity in the process of defence response against pathogenic micro·organisms．Temporin一1 CEa，one 1 7 amino acids amphibian antimicrobial peptide precursor isolated from the Chinese brown frog Rana skin，iS positively charged with amphiphilic a-helix structure and exhibit good anti-cancer effect． The main purpose of the present study iS to explore the anti-cancer effects and the possible mechanisms of temporin．1 CEa on breast cancer cells．We firstly determined the growth inhibition activity of temporin一1 CEa against variety of tumor cell lines including three kinds of breast cancer lines(MCF-7，MDA-MB23 1，Bcap一37 cell line)using MTT method． Then the manner of peptide．induced cell death and the possible mechanisms of the anticancer effects of temporin一1 CEa were investigated through