酶与辅酶(enzymes and coenzymes)课件.ppt

米氏方程的推导 四、酶的分离、纯化及活力测定 （一）酶的分离纯化 1．选材 2．破碎细胞 3．抽提 4．去核酸、去多糖 5．纯化 6．保存 由于酶的特殊性，在提纯过程中要注意 : 1．全部操作在低温0～4℃。 2．在分离提纯过程中，不能剧烈搅拌。 3．在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、少量β-巯基乙醇。 4．在分离提纯过程中要不断测定酶活力和蛋白质浓度，从而求得比活力，还要计算总活力。 比活力＝ 酶活力 蛋白质浓度 总活力＝单位体积的酶活力(U/ml)×分离溶液总体积(ml) （二）酶活力的测定 酶活力（enzyme activity, 也称酶活性） 酶活力的测定 1．测定酶活力时应注意几点 （1）应测反应初速度（initial velocity or initial speed） （2）酶的反应速度一般用单位时间内产物的增加量来表示。 （3）测酶活力时应使反应温度、pH、离子强度和底物浓度等因素保持恒定。 （4）测定酶反应速度时，应使[S][E]。 产 物 浓 度 [P] (t) 2．酶活力和比活力表示方式 （1）酶活力（enzyme activity） （2）酶的比活力（specific activity，也称比活性） 比活力：指每mg蛋白质所具有的酶活力，一般用U/mg蛋白质来表示，比活力说明酶的纯度。 比活力= 酶活力（U/ml）/蛋白质浓度（mg/ml） （3）转换数（TN or kcat) （4）分子活性（molecular activity） （5）催化中心活性（catalytic center activity） 3. 酶活力的测定方法 （1）分光光度法（spectrophotometry） 该法要求酶的底物和产物在紫外或可见光部分光吸收不同。 优点： 简便、迅速、准确。 一个样品可多次测定，有利于动力学研究。 可检测到10-9mol/L水平的变化。 （2）荧光法（fluorometry） 该法要求酶反应的底物或产物有荧光变化。 主要的优点：灵敏度很高，可以检测10-12mol/L的样品。 酶蛋白分子中的Tyr、Trp、Phe残基以及一些辅酶、辅基，如NADH、NADPH、FMN、FAD等都能发出荧光。 （3）酶偶联分析法(enzyme coupling assay) 第一个酶的产物为第二个酶的底物，这两个酶系统在一起反应。 （4）电化学法（electrochemical method） 五、酶的作用动力学（kinetics） （一）底物浓度对酶反应速度的影响 1．米氏方程的提出 中间复合物学说： 第一步: E+S ES 第二步: ES→E+P V∝[ES] 1913年Michaelis和Menten推导了米氏方程 2．米氏方程的推导 基本前提： 反应方程式: 在米氏方程推导中引入3个假设: （1）P→0 忽略 这步反应 （2）∵ [S][E] ∴[S] － [ES]≈[S] （3）E+S ES平衡，要求k3k2 。 中间复合物学说: E+S ES→E+P V∝[ES] 令： 将（4）代入（3），则： [ES]生成速度： ，[ES]分解速度： 即： 则： (1) 经整理得： 由于酶促反应速度由[ES]决定，即 ，所以 (2) 将（2）代入（1）得： (3) 当酶反应体系处于恒态时： 当[Et]=[ES]时， (4) 所以 恒态法 3．米氏方程的讨论 （1）米氏方程与一级反应和零级反应 （2）Vmax与酶的转换数 （3）酶被底物饱和的百分数 （4）米氏公式的实际应用 （5）米氏方程——双曲线方程形式 米氏方程 经重排，两边 -VmaxKm等，得 4．米氏常数的意义 有关米氏常数说明几点 （1）Km是酶的一个特征性常数，只与酶的性质有关，与酶的浓度无关 （2）如酶能催化几种不同的底物，对每种底物都有一个特定的Km值，其中Km值最小的称该酶的最适底物。 （3）Km除了与底物类别有关，还与pH、温度有关， 所以Km是一个物理常数，是对一定的底物、一定的pH、一定的温度而言的。 （4）Km与Ks：Km不等于Ks，只有在特殊情况下即 和底物的亲和力。 5．米氏常数的求法 （1）v对[S]作图 （2）双倒数作图法（Lineweaver-Burk作图法） （3）v对 作图（Eadie-Hofstee法） （4） [S]/v 对[S]作图（Hanes-Woolf法） （5）直接线性作图法 （Eise