酶分子修饰--课件.pptVIP

* 定向进化的发展与展望 国内进行定向进化研究的起步较晚，最初进行这方面研究的是吉林大学酶工程教育部重点实验室张今研究小组，他们以天冬氨酸酶为模型提出了一种酶法体外随机-定位诱变的改造酶的方法，该方法通过控制DNA合成的底物种类和浓度比例实现碱基对的错配，对目的基因既采用随机突变增加突变位点，以快速产生优质酶，又使其突变受到一定限制，以减少筛选突变体的工作量。利用该方法他们对天冬氨酸酶进行了成功的改造，提高了天冬氨酸酶的活力。江南大学的孙志浩研究小组用易错PCR和DNA改组组合方法，结合两步法筛选系统，对D-泛解酸内酯水解酶进行了定向进化，取得了很好的效果。国内许多高等院校与科研院所的研究小组也相继开始了蛋白质定向进化方面的工作。 * 定向进化的发展与展望 实验证明：定向进化不仅可以应用于生物催化剂活性、热稳定和耐操作条件性能的显著提高而且还可以应用到疫苗和制药领域，对疫苗和蛋白类药物进行改造，在各个应用领域，定向进化都取得了显著成功。定向进化为生物催化剂从实验室研究走向工业应用提供了强大的手段。 酶的体外定向进化是非常有效的更接近于自然进化的蛋白质工程研究的新策略。它不仅能使酶进化出非天然特性, 还能定向进化某一代谢途径; 不仅能进化出具有单一优良特性的酶, 还可能使已分别优化的酶的两个或多个特性叠加, 产生具有多项优化功能的酶,进而发展和丰富酶类资源; 完全在试管中进行的酶(或蛋白质) 的体外定向进化使在自然界需要几百万年的进化过程缩短至几年，这无疑是蛋白质工程技术发展的一大飞跃。目前，对一些酶(或蛋白质)、砷酸盐解毒途径、抗辐射性、生物合成途径、对映体选择性、抗体库以及DNA结合位点定向进化的可喜成果令众多的相关领域的科学家为之振奋。可见，进化能发生在自然界，也能发生在试管中，它与合理设计互补，将会使分子生物学家更加得心应手地设计和改造酶(或蛋白质)分子，将使蛋白质工程学更加显示出强大的威力和诱人的前景。 * 定向进化的发展与展望 将生物信息学以及统计学等学科引入到蛋白质的定向进化中来，并结合计算机技术进行合理化设计，将此作为定向进化的辅助方法，能够有效的降低定向进化过程的操作强度和提高蛋白质定向进化成功的几率。Arnold等人用计算的方法，限制了突变库的大小，减小了筛选正向突变体的工作量。利用统计学方法并结合构建的突变模型，对有限突变文库中发生的有益突变的位点分析发现：突变库中有益突变常常集中发生在那些对替换容忍程度大的氨基酸残基上。随着基因工程技术、蛋白质工程技术以及高通量筛选技术的迅速发展，定向进化技术将成为获得新酶的一个有效、快捷的手段。这将为工业生产提供更多性能优良的酶制剂。 * 定向进化的基本概念 在人工模拟自然进化过程的条件下，通过容错PCR、DNA改组、交错延伸技术、随机引物引导重组和递增截短技术等方法对编码酶的基因进行突变和体外重组，经高通量筛选获得性能更优良或全新的酶。本法不需了解酶的结构信息，因此称为非理性化设计。 * 定向进化的原理及目的 定向进化是利用Taq DNA多聚酶不具有3’?5’校对功能的性质，并结合基因工程现有技术手段，在待进化酶基因的PCR扩增反应中，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，并构建突变库。凭借定向的选择方法，选出所需性质优化的酶，从而排除其他突变体。定向进化的基本规则是：“获取所筛选的突变体” 。简言之，定向进化就是随机突变同选择或筛选相结合。与自然进化不同，定向进化是人为引发的，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的。酶分子定向进化的目的在于，人为地改变天然生物催化剂的某些性质，增强在不良环境中的稳定性，创造天然生物催化剂所不具备的某些优良特性甚至创造出新的活性，产生新的催化能力，扩大生物催化剂的应用范围。 * 酶定向进化的常用方法 酶定向进化通常分3步进行：(1)通过随机突变和(或)基因体外重组创造基因多样性；(2)导入适当载体后构建突变文库；(3)通过灵敏的筛选方法，选择阳性突变子。这个过程可重复循环，直至得到预期性状的酶 。其中容错PCR(error-prone PCR)技术、化学诱变剂介导的突变、致突变株产生随机突变和随机寡核苷酸突变等称为基因随机突变；而DNA改组(DNA shufling)等称为基因重组技术。 * 基因随机突变 容错PCR技术：本法是一种相对简单、快速廉价的随机突变方法。通过改变PCR反应条件，使扩增的基因出现少量碱基错配，从而导致目的基因的随机突变。 Moore等人对鼠伤寒沙门菌产生的α-天冬氨酰二肽酶(aspartyl dipeptidase)进行改良，经两次容错PCR引入随机突变，并结合DNA 改组和正向选择筛选得pepEM3074突变株，其酶活力比野生菌提