产物的方法—反相色谱－电化学检测分析法.PDF

实验与技术 快速、灵敏检测生物样本中单胺类递质及其代谢 产物的方法— 反相色谱-电化学检测分析法 叶惟泠 中国科学院上海生理研究所，200031） 单胺类神经递质，多巴胺 (DA)、去甲肾上腺 表1罗列了近十年来成功地测定了生物样本中这 素(NA)、肾上腺素(A)和5-羟色胺(5-HT)是哺乳 类化合物的范例。由于令人满意地解决了同时分 动物和人类中枢重要的信息传递物质。检测脑和体 离、检测这一系列化合物的方法，因而不仅能测出 液中微量的单胺递质及其代谢产物对研究这类递质 递质的更新率，还可通过分析单位时间内底物降解 的生理功能，与递质代谢异常有关的疾病的诊断和 量或产物生成量，测出单胺递质生物合或酶和降解 药物及手术疗效的鉴定都有重要意义。自1973年 酶的活性2。 Rissinger1等用高效液相色谱 (HPLC)-电化学 二、电化学检测器的结构及其检测原理 检测法 E（C分析了儿茶酚胺 CA，包括DA、NA和 A 以来，由于高灵敏电化学检测器与高效反相色 现代的电化学检测器以安倍型的最常见5〔,12， 普柱配套使用，该检测法已成为分析这一系列化合 它采用由工作电极、参比电极和辅助电极组成三电 物的最广为应用的手段2〔。 极恒电势器系统。这一设计的主要优点是：能保证 本文介绍了反相色谱 (RPLC)-EC法分析单 电流不通过参比电极以维持其电位水平的恒定，使 胺防类递质其代谢产物的一般原理和优点，讨论了 工作电极与参比电极之间的电势稳定在所要求的水 影响分离和检测的各种因素。 平；辅助电极的作用是为电流提供通路，使在无电 流通过参比电极的情况下维持回路内的电流平衡。 方法的优点 它的工作电极以用糠酮和石墨制成的玻碳电极及用 自五十年代初单胺类递质问世以来，分离、检测 树脂和石墨制成的碳糊电极为最常见。玻碳电极几 这类递质及其代谢产物的方法不断改进。较早的荧 乎可适用于液相色谱的任何溶剂，适用电位很 光分光光度分析法和HPLC-紫外检测分析法，检 宽2〔。碳糊电极优点是它的电极电位为负，残余 测灵敏度至多达ng水平3〔，不能用于分析含单胺 电流比玻碳和铂电极低一个数量级，噪音低而规 量很低的生物样本；且用荧光分光光度法仅能检测 则 13，缺点是因树脂易被有机溶剂溶解，只能在 CA的总量2〔。用气相色谱、质谱、HPLC-荧光 流动相甲醇含量不超过20—30 的条件下使 检测和放射酶学分析法，虽检测效果很好，但分别 用 1〔4。 存在价格昂贵、衍生化手续麻烦、耗时、不能在同 应用EC的先决条件是被测物质必须具有电化 一生物样本上同时测定这类化合物等缺点2〔,4—8。 学活性。单胺类递质及其代谢产物或苯环上、或吲 用离子交换色谱-EC分析的缺点是分离单胺需用阳 哚环上有羟基或甲氧基，当工作电极与参比电极之 离子交换色谱，而分离酸性代谢产物需用阴离子交 间的电位维持在某一水平时，这些化合物被氧化， 换色谱；并且离子交换色谱的柱效和重复性均较 生成醌或醌亚胺。方程式a、bc展示了它们在工作 RPLC差，分离时对pH的要求也较严格4RPLC 电极被氧化的过程5〔。表2列出了这类化合物的 -EC分析法既有上述方法的优点，又有快速、操 氧化电位。凡有甲氧基的代谢产物，由于需用较高的 作系统简便、溶剂记忆效应小、能同时测定单胺递 能量将甲氧基裂开 (cleave)，因而它们的氧化电位