枯草芽孢杆菌表达手册 个人翻译中文版.pdfVIP

枯草芽孢杆菌表达载体 产品信息和说明 2005年11 月 目录 1.简介 3 2. pHT 载体 3 2.1. pHT01 载体图谱 4 2.2. pHT43 载体图谱 5 2.3. pHT01 衍生物中标签的定位 5 3. 实验方案 6 4. 参考文献 6 5. 订单信息，运输和存储 6 本载体系统由德国拜罗伊特大学遗传研究所的沃尔夫冈·舒曼实验室 开发。 仅用于科研！ 本手册由 wy135033405 翻译 百度文库首发 任何意见请 PM 枯草芽孢杆菌表达载体 通过质粒在枯草芽孢杆菌中高效表达胞内/胞外重组蛋白 1.简介 革兰氏阳性菌因其在农业，医疗和食品生物技术和重组蛋白生产等方面的贡献而广为人 知。在所有革兰氏阳性菌中，枯草芽孢杆菌载体因下列原因尤为引人瞩目。（一）无致病性， 且一般认为安全的有机体；（二）无明显的密码子偏好性；（三）可直接将功能性胞外蛋白分 泌到培养基中（目前，大约 60 ％的市售酶由芽孢杆菌生产）；（四）具备包含转录，翻译， 蛋白质折叠、分泌机制，遗传操作和大规模发酵的大信息量机体。 但是下述两个障碍减少了枯草芽孢杆菌的使用：（一）产生一定数目的识别并降解外源 蛋白的胞外蛋白酶；（二）载体质粒稳定性。第一个障碍已因蛋白酶缺失株的构建而基本解 决 。第二个因引入使用θ-复制模式质粒被完全克服，如由天然质粒pAMβ1 和pBS72 衍生的 一些质粒（Jannière等，1990；Titok等，2003 ）。 最近，基于大肠杆菌 - 枯草杆菌穿梭质粒pMTLBS72 的四种不同表达载体的构建和使用展 示出全面的结构稳定性，业已出版（Nguyen等，2005 ）。 两个新的载体pHT01 和pHT43 允许在细胞质中高水平表达重组蛋白，其中pHT43 载体 引导重组蛋白到培养基。这两个载体基于强σA-依赖性启动子的枯草杆菌groE操纵子通过添 加lac操纵子改造成为一种高效可控的（IPTG诱导的）启动子。pHT01 衍生载体可与 8×His 标签（pHT08 ），链球菌标签（pHT9 ）或C - Myc 的标签（pHT10 ）相结合。 2. pHT 载体 所有在枯草芽孢杆菌的groESL操纵子之前使强启动子与lac操纵子融合的载体都可通 过加入IPTG进行诱导。尽管当未添加诱导物时表达组件的背景表达水平很低，还是成功从 约 1300 种诱导因子中筛选出一种来使用bgaB报道基因（Phan等，2005 ）。当分别将htpG 和pbp E基因融合到groE启动子时，加入IPTG后，表达的重组蛋白可能分别占细胞总蛋白的 10%和 13% （Phan等，2005 ）。热纤梭菌的amyQα-淀粉酶和纤维素酶A 、B的高水平表达实 验证实。该载体还插入了一个高效SD序列以及一个多克隆位点（BamH I, Xba I, Aat II, Sma I）。编码α-淀粉酶的amyQ基因的信号肽编码区域与pHT01 的SD序列融合，构成了pHT43， 以此获得分泌的重组蛋白。 2.1. pHT01 载体图谱 Pgrac : Pgrac 启动子（包含groE 启动子； lacO 操纵子和 gsiB SD 序列） CoIE1 ori: CoIE1 起始子 AmpR : 青霉素抗性基因 LacI: lacI 基因 (lac 抑制子) CmR : 氯霉素抗性基因 完整的DNA序列可根据要求提供 2.2. pHT43 载体图谱 Pgrac : Pgrac 启动子（包含 groE 启动 子； lacO 操纵子和 gsiB SD 序列） CoIE1 ori: CoIE1 起始子 AmpR : 青霉素抗性基因 LacI: lacI 基因 (lac 抑制子) CmR : 氯霉素抗性基因 SamyQ: amyQ 信号序列 完整的DNA序列可根据要求提供 2.3. pHT01 衍生物中标签的定位 pHT08 中 8×His 标签的定位