青霉g蛋白信号通路对糖苷水解酶合成调控初探及其在构建表达系统中的应用微生物学专业论文.docxVIP

山东大学博士学位论文目录 山东大学博士学位论文 目录 摘要 一I ABSTRACT ．V 符号说明 ．1x 第一章绪论 ．1 1．1真菌糖苷水解酶的组成 ．1 1．1．1真菌木质纤维素酶 ．．1 1．1．2真菌半纤维素酶 一2 1．1．3真菌淀粉酶 2 1．2丝状真菌纤维素酶和淀粉酶合成调控研究进展 ．3 1．2．1碳源的诱导作用 ．．3 1．2．2纤维素酶和淀粉酶转录水平的调控 ．．5 1．2．3转录后水平的调控 ．．7 1．2．4糖转运蛋白的调控作用 ．．7 1．2．5 RaLS信号途径对纤维素酶的表达调控作用 8 1．2．6丝状真菌中G蛋白信号途径的功能及其对产酶的调控作用 ．8 1．3蛋白表达系统概述 1 2 1．3．1原核表达系统 1 2 1．3．2真核表达系统 1 3 1．4本研究的立题依据和研究内容 19 第二章草酸青霉纤维素酶信号转导相关基因的预测及功能研究 21 2．1实验材料与方法 22 2．1．1菌株、质粒及培养条件 22 2．1．2常用储备液 23 2．1．3常用试剂与实验仪器 23 2．1．4 PCR引物 24 2．1．5实验具体操作方法 27 2．2结果与讨论 30 2．2．1草酸青霉中纤维素酶信号转导相关基因的筛选 30 2．2．2草酸青霉纤维素酶信号转导相关基因的敲除 31 2．2．3纤维素酶信号转导相关基因缺失株的表型分析 33 2．2．4纤维素酶信号转导相关基因缺失株的产酶分析 35 本章小结 ．37 第三章草酸青霉G蛋白．cAMP信号转导通路对糖苷水解酶的表达调控研究 一39 3．1实验材料与方法 40 3．1．1菌株、质粒及培养条件 40 万方数据 山东大学博士学位论文3．1．2常用储备液 山东大学博士学位论文 3．1．2常用储备液 40 3．1．3常用试剂与实验仪器 4l 3．1．4 PCR引物 42 3．1．5实验具体操作方法 ： 43 3．2结果和讨论 5 1 3．2．1草酸青霉PGA3的鉴定与分析 5 1 3．2．2 G蛋白PGA3对草酸青霉的形态发生和生长的影响 52 3．2．3草酸青霉PGA3对胞内淀粉酶、纤维素酶以及B．葡萄糖苷酶的表达调控 57 3．2．4 PGA3通过调节转录因子的表达从而调节淀粉酶和纤维素酶的表达 ．6 l 3．2．5 PGA3通过调节胞内cAMP的水平来发挥调控作用 ．62 3．2．6 PGA3介导的G蛋白一cAMP信号通路对淀粉酶和纤维素酶的表达调控模式64 本章小结 ．66 第四章草酸青霉低背景筛酶系统的构建和应用研究 69 4．1实验材料与方法 69 4．1．1菌株、质粒及培养条件 69 4．1．2常用储备液 70 4．1．3常用试剂与实验仪器 70 4．1．4 PCR引物 ．． ．7 l 4．1．5实验具体操作方法 72 4．2结果和讨论 75 4．2．1草酸青霉中干净的蛋白表达背景的获得 75 4．2．2草酸青霉组成型强启动子的筛选 79 4．2．3在△15A中高效表达低丰度的木质纤维素酶 ．82 4．2．4 B．葡萄糖苷酶以及木聚糖酶的放大培养 ．82 4．2．5含过表达木质纤维素酶的重组纤维素酶系性质 83 4．2．6强启动子在草酸青霉中Deni—l中的应用 86 本章小结 ．88 第五章运用G蛋白信号转导通路原理提高重组蛋白在低背景表达系统中的表达量 ．．89 5．1实验材料与方法 89 5．1．1菌株、质粒及培养条件 89 5．1．2常用储备液 90 5．】．3常用试剂与实验仪器 90 5．1．4 PCR引物 90 5．1．5实验具体操作方法 9 1 5．2结果与讨论 98 5．2．1过表达淀粉酶转录激活因子AmvR构建高效表达宿主 98 万方数据 山东大学博士学位论文5．2．2过表达株P口，砂J鲥启动子效率的分析 山东大学博士学位论文 5．2．2过表达株P口，砂J鲥启动子效率的分析 ．10l 5．2．3激活菌株中过表达AmyR以提高胞外淀粉酶Amyl5A分泌量 ．102 5．2．4敲除淀粉酶Amyl5A获得较干净的蛋白表达背景 ．103 5．2．5纤维二糖水解酶CBHl以及内切葡聚糖酶EGI在A11△中的重组表达 104 本章小结 105 论文创新性结果总结与展望 1 07 参考文献 1 09 攻读学位期间己(待)发表的学术论文 133 致谢 ．．135 万方数据 山东大学博士学位论文摘要 山东大学博士学位论文 摘要 植物为主的生物质资源是自然界最大的再生资源库，也被看作生物燃料以及 生物炼制最大的原料库，因此有效地降解这些以多糖(纤维素或淀粉)形式储存 的生物质是实现可再生资源利用的关键。利用微生物产生的糖苷水解酶来降解自 然界储藏的淀粉或木质纤维素是生物质利用的有效途径。青霉是自然界中广泛存 在的一种腐生丝