aquaporin3与哺乳动物胚胎着床相关性的研究生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

目录一、摘要 目录 一、摘要 。1 (一)中文摘要 ． 一1 (二)英文摘要 5 二、正文 。10 前言月Ⅱ舌 ．10U．1 第一部分 ．．． 12 (一)前言(一)日IJ舌 ．．12一．1 (二)材料与方法 ．12 (三)结果 ．17 (四)讨论 ．23 (五)结论 ．25 (六)参考文献 ．25 第二部分 28 (一)前言(一，)日IJ舌 ．28．Z6 (二)材料与方法 ．29 (三)结果 ．42 (四)讨论 ．53 (五)结论 ．55 万方数据 (六)参考文献 (六)参考文献 ．56 三、综述 ．60 (一)综述正文 ．．60 (二)参考文献 ．66 四、攻读学位期间发表论文、参与课题及参加会议情况 71 五、致谢 72 万方数据 大连医科大学硕士学位论文Aquaporin 大连医科大学硕士学位论文 Aquaporin 3在哺乳动物胚胎着床中的相关性研究 硕士研究生： 崔丹 指导教师： 孔英教授 指导小组： 隋琳琳讲师 专业名称：生物化学与分子生物学 摘要 一、目的 胚泡着床是生殖过程中的关键环节和限速步骤，这一过程包括胚泡与子 宫内膜上皮细胞的识别、定位、黏附，进而穿过基底膜植入到子宫内膜。子 宫内膜容受状态受雌激素(estrogen，E2)、孕激素(progestin，P4)、细胞因 子和生长因子等许多因素的共同调节，使胚泡与子宫双方发生一系列同步的 变化，活化的胚胎只有在子宫内膜进入“着床窗口期”才能着床，此时子宫腔 内的液体减少，使游离的胚胎与子宫内膜充分接触，有利于胚胎黏附在子宫 内膜上。水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)在细胞膜上广泛表达，完成对各 种上皮和内皮组织的液体转运以维持机体内环境稳定外，并参与血管生成、 肿瘤细胞迁移与侵袭、组织损伤修复、维持细胞稳态和免疫功能等多种重要 生命活动。有研究表明胚胎着床过程中子宫内膜AQPs表达存在变化，但AQPs 对胚胎着床调控机制并不明确。本文检测Aquaporin 3(AQP3)在小鼠不同 动情周期和自然早孕小鼠子宫内膜的表达及分布情况，并分析AQP3在人不 同时期子宫内膜及不同接受态子宫内膜细胞中的表达，探讨孕、雌激素对 AQP3表达的影响，以及调控AQP3表达对胚胎与不同接受状态子宫内膜黏附、 侵袭和迁移影响。明确其在胚胎着床过程中的功能及作用机制，对生殖疾病 治疗以及提高辅助生殖成功率具有一定意义。 二、方法 万方数据 大连医科大学硕士学位论文(一)水通道蛋白3在不同时期小鼠子宫内膜及蜕膜化组织中表达 大连医科大学硕士学位论文 (一)水通道蛋白3在不同时期小鼠子宫内膜及蜕膜化组织中表达 1．用阴道涂片的方法确定小鼠的动情周期；将不同动情周期小鼠的子宫解剖组 织用37℃PBS清洗后，拍照观察子宫大小充水情况；用免疫组化、Western blot 及Real．time PCR技术，检N4,鼠不同动情周期中AQP3表达与定位情况； 2．用免疫组化检Nd,鼠妊娠Dl和D5，AQP3分布及表达情况，并用Western blot 及Real．time PCR分析其表达情况； 3．小鼠妊娠D8天，用免疫组化的方法分析小鼠着床位点和非着床位点的子宫内 膜与蜕膜组织中AQP3的分布及表达情况； (一-)AQP3随月经周期变化及在胚胎着床中的机制研究 1．通过免疫组化方法检测AQP3在不同月经周期子宫内膜中的表达及分布； 2．通过Western blot、Real．time PCR及免疫荧光方法检测AQP3在不同接受态子 宫内膜细胞中的表达与分布情况； 3．利用脂质体转染法将重组的AQP3过表达质粒转染到人子宫内膜细胞系 HEC一1A细胞(低接受态子宫内膜上皮细胞)，利用脂质体转染法将重组的 AQP3干扰质粒(AQP3．siRNA)转染到人子宫内膜细胞系RL95．2细胞(高 接受态子宫内膜上皮细胞)； 4．通过Transwell小室、细胞划痕检测AQP3对子宫内膜细胞的侵袭和迁移的影 响；用JAR细胞模拟胚胎，通过黏附实验检测AQP3对子宫内膜细胞与胚胎 细胞之间黏附情况； 5．通过Western blot、Real．time PCR检测用不同浓度孕激素、雌激素和卵巢类固 醇类激素对AQP3基因及蛋白表达的影响； 6．通过Western blot检测，E2P4通过AQP3介导RL95．2细胞发生EMT；通过 细胞划痕和Transwell实验分析卵巢类固醇激素通过AQP3介导RL95．2细胞 的迁移和侵袭； 7．通过免疫共沉淀和免疫荧光实验检测AQP3与Ezrin之间的相互作用；通过 Western blot、Real．time PCR检测，卵巢类固醇激素和AQP3。siRNA作用 RL95．2细胞后，检测AQP3和Ezrin之间调控关系； 8