三维肝癌类组织体模型建立及肺侵袭关联蛋白筛查生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

博士论文 博士论文 三维肝癌类组织模型建立及肺侵袭关联蛋白筛查 三维肝癌类组织体模型建立及肺侵袭关联蛋白筛查 中文摘要 平面培养模型是研究肝癌的发生发展和转移复发机制的较好模型，三维培养 模型在平面培养模型的基础上更接近在体状况。目前还缺乏在三维状态下研究肝 癌侵袭、转移等分子机制的实验模型。本研究应用了旋转壁式生物反应器和 PLGA支架材料，旋转壁式反应器具有微重力和低剪切力的特点，PLGA生物支 架能更好地支撑细胞形成的类组织结构。本文首先将人高转移性肝癌细胞 MHCC97H利用生物反应器进行有PLGA支架的三维培养，MHCC97H细胞和支 架粘附形成团块，随着培养时间的延长，细胞团聚集体更加紧密，且表面光滑， 行成高转移潜能肝癌类组织体；组化显示，细胞紧密排列，电镜超微结构显示类 组织体细胞具有了组织细胞特有的一些结构，例如桥粒和紧密连接。临床上葡萄 糖、LDH、ALB、7-GT和AFP常用来评价肝组织功能。与平面培养细胞相比， 类组织体形成过程中葡萄糖消耗下降，LDH分泌增加，显示在类组织体形成过 程中葡萄糖分解增强而葡萄糖氧化受到了抑制；类组织体形成过程中，)-GT和 AFP的分泌也明显高于平面培养细胞，这些结果显示类组织体获得了HCC特征 性酶(蛋白)产生和分泌的能力，并且结果同HCC病人血清病理特征一致。与 平面培养细胞相比，流式细胞技术显示类组织体中较低的S和(32．M期细胞，说 明其中的细胞生长和增殖不活跃。对类组织体HCC特征基因(AFP，ALB)、粘附 分子基因(ICAMl，CD29)以及转移相关基因(CD44，E．cadherin，MMP9，MMP2) 的检测发现三维培养的不同时段尤其是第15天，这些基因的表达明显不同于平 面培养细胞，ICAMl和CD29的上调表达说明类组织体呈现了明显的细胞相互 作用和连接的组织特征；白蛋白和AFP的表达增加和上述培养上清中的结果一 致，说明类组织体部分具有了肝脏和肝癌组织的特征。肝癌转移相关基因CD44， MMP9，ICAMl，CD29表达增加和E一钙粘素的表达降低同临床转移性HCC特征 相似。这些结果显示该模型不仅是HCC模型也和肝癌高转移潜能相关。免疫组 织化学方法对ICAMl、CD29和AFP在类组织体中的表达检测结果显示这些蛋 白相对平面培养细胞具有强表达，这些蛋白表达的模式与上述基因表达的模式一 致。类组织体原位种植裸鼠肝脏形成的肿瘤组织结构呈现典型的HCC病理组织 特征，HCC转移相关蛋白CK7，CK8，CKl9和MMP9在再生瘤中具有高表达， 证明再生瘤具有高转移潜能且存在肝内播散；在所有待测裸鼠的肺组织连续切片 病理分析中，均发现有癌细胞转移，说明发生了肝癌肺转移，证实类组织体具有 博士论文 博士论文 三维肝癌类组织模型建立及肺侵袭关联蛋白筛查 肝内播散和远端转移的能力。以上结果表明本文成功地建立了体外人高转移潜能 肝癌类组织体模型，该模型建立所使用的类组织体原位移植形成肿瘤的方法可能 成为建立动物模型的新方法，该模型也可能在药物筛选等方面具有良好应用。本 研究还使用定量蛋白质组学方法对平面培养细胞和类组织体的蛋白组学性质也 进行了分析，表明三维状态下的肝癌细胞在众多方面明显不同于两维的人肝癌细 胞系。细胞三维形态结构及其周边组织结构对于肿瘤细胞恶性生物学功能的维持 十分重要。 肿瘤转移的靶器官环境对肿瘤细胞的侵袭和转移病理机制也有重要影响。 肺转移是肝癌远端转移的主要形式。为了构建肝癌肺侵袭实验模型，体外再现癌 细胞从黏附、侵袭到肺内癌巢形成的病理全过程，解决三维状态下缺少理想肝癌 侵袭转移实验模型问题及肝癌侵袭转移“过程关键蛋白筛查缺少理想标本实验 体系问题，也为了深入解析在三维状态下肿瘤细胞侵袭转移恶性生物学特征的分 子机制，在高转移潜能人肝癌细胞类组织体研究的基础之上，研究首先对不同转 移潜能的人肝癌细胞Hep3B和MHCC97H形成的类组织体进行了比较定量蛋白组学 研究，获得三维培养状态下与转移关联的基因，并检测了其中部分基因在肝癌肺 侵袭过程中的表达。接下来将高转移潜能人肝癌细胞系与裸鼠肺组织块共同旋转 培养，建立了肝癌肺侵袭实验模型，对该病理过程中不同时段的混合类组织体进 行比较定量蛋白质组学筛查，以期获得肺侵袭过程关联蛋白分子，研究其在侵袭 转移中的生物学功能，明确其参与肝癌肺侵袭转移的分子机制；在发现的侵袭转 移关联蛋白中，对冠蛋白1B(coronin 1B)的研究发现，该蛋白受抑制的细胞 的运动速度比对照细胞降低了，而经肺组织粗提物诱导之后，该细胞的运动速度 又明