gipc2相互作用蛋白的研究生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

北京协和医学院硕士学位论文中文摘要 北京协和医学院硕士学位论文 中文摘要 研究背景与目的：GIPC2是--种天然的小分子蛋白，现发现其在多种肿瘤中存在 表达量的变化，女HGIPC2在胃癌中上调，在肾癌、急性淋巴细胞白血病和肾上腺皮 质癌中却下调。然而到目前为止GIPC2在肿瘤发生中的功能尚不清楚，研究报道 GIPC2的相互作用蛋白也很少。因此，本研究旨在寻找GIPC2的相互作用蛋白，从 而为研究GIPC2的生物学功能提供有价值的线索。 研究方法：以酵母双杂交(H2Y)和免疫沉淀一质谱联用两种方法进行GIPC2相 互作用蛋白的初筛，主要从GIPC2 PDZ结构域筛选PDZ配体文库、GIPC2筛选 cDNA文库及GIPC2筛选293T细胞表达蛋白三条路线进行研究。首先通过生物学 功能对初筛结果进行筛选得到候选蛋白，再根据蛋白表达的组织特异性和种属特异 性，在PCI2和293T等细胞中通过荧光共振能量转移(FRET)、免疫共沉淀(CO—IP) 等方法进行相互作用蛋白的验证。 研究结果：在酵母双杂交系统中，通过GIPC2 PDZ结构域筛选PDZ配体文库的 方法，得到14个GIPC2的候选配体蛋白；通过GIPC2筛选cDNA文库的方法得到 4个GIPC2的候选配体蛋白。利用免疫沉淀．质谱联用的方法在293T细胞中筛选到 上百种可能的配体蛋白。将以上得到的所有候选蛋白从生物学功能和亚细胞定位等 方面进行进一步筛选，共得到19个候选蛋白。在PCI2细胞中，利用FRET的方法 对GIPC2和19个候选蛋白的相互作用进行验证，均呈阳性。在293T细胞中，通过 CO．IP验证，确定NONO为GIPC2的相互作用蛋白。 研究结论：通过酵母双杂交、免疫沉淀．质谱联用、荧光共振能量转移、免疫共沉 淀等方法，我们成功筛选并验证得到GIPC2新的相互作用蛋白，为GIPC2相关生 物学功能的研究提供重要的线索。 关键阔：GIPC2：酵母双杂交；免疫沉淀．质谱联用；荧光共振能量转移；免疫共 沉淀：相互作用蛋白 4 万方数据 北京协和医学院硕士学位论文Abstract 北京协和医学院硕士学位论文 Abstract Obj ective：GIPC2 is a natural，small molecular protein．We have found expression level of GIPC2 changes in a variety of tumors．For example，GIPC2 is upregulated in gastric cancer,while downregulted in kidney cancer,acute lymphoblastic leukemia and adrenal cortical carcinoma．However,GIPC2 function in the tumorigenesis is still unclear, and interaction proteins of GIPC2 are rarely reported．In this study,we want to find new protein—prtein interactions of GIPC2，which can play important roles in the study of GIPC2 biological function． Methods：First，we use two methods，yeast-two—hybrid and immunoprecipitation．mass spectrometry to study GIPC2 interaction protein．We have three points：GIPC2 PDZ domain screening PDZ ligand library，GIPC2 screening cDNA library and GIPC2 screening 293T cells expressing protein three to validate protein—protein interaction．Then，we screen the initial results by biological functions to obtain candidate proteins．Thirdly，we considerate the tissue specificity and species specificity of protein expression，We confirm the protein-protein interactions in PC 1 2 an