钙稳态在硒拮抗镉致lmh细胞内质网应激中的作用兽医学;临床兽医学专业论文.docxVIP

Classified Classified Index：$856 Code：10224 Confidential(yes／no)no NO．：120610477 Dissertation for the Master Degree Selenium Alleviated Cadmium．．induced Endoplasmic Reticulum Stress via Regulation of Calcium Homeostasiso asis in LMHMH ells Candidate：Wang Lili Supervisor：Associate Professor Li Jinlong Degree Category：Master of Agriculture College：College of Veterinary Medicine First level discipline：Veterinary Medicine Second level discipline：Clinical Veterinary Medicine Harbin China June 2015 万方数据 目录 目录 J㈣㈣㈣㈣ 曼曼烹鼍曼曼寰曼曼量曼曼量量曼曼鼍舅舅黑皇舅曼宁Y277～～～～1 752一 目 录 1．1．1镉的污染与危害 1 1．3镉与氧化应激 2 1．4钙连蛋白(CNX)／钙网蛋白(CRT) 3 1．5镉与钙的相互作用 ．4 1．5．1镉与钙的理化特性 4 1．5．3镉与钙的结合受体 5 2材料与方法 7 2．1试验材料与方法 ．7 2．2．1鸡CNX和CRT重组表达质粒构建 8 2．2．2鸡CNX和CRT重组蛋白表达 9 2．2．3鸡CNX和CRT多克隆抗体的制备 9 2．3．2 LMH细胞增殖生长曲线的测定方法 ．10 2．5．1硒、镉致LMH细胞半数抑制浓度(IC50)的测定 ．．10 2．6．2内质网应激标志分子的引物设计 ．．1 1 万方数据 东北农业大学农学硕士学位论义2．6．3内质网应激标志分子表达的测定 东北农业大学农学硕士学位论义 2．6．3内质网应激标志分子表达的测定 ．．12 2．7细胞自噬的测定 1 2 2．7．1细胞自噬泡的观察 ．12 2．7．2细胞自噬标志基因表达测定 ．．12 2．8细胞内钙稳态的测定 13 2．8．1细胞内游离钙离子含量的测定 ．．1 3 2．8．2细胞钙稳态调控相关基因表达的测定 ．．1 3 2．9内质网钙稳态调控蛋白CNX与CRT表达水平的测定 ．．1 3 3．0数据统计与分析 13 3结果 ．．14 3．1鸡CNX和CRT多克隆抗体的制备 14 3．1．1鸡肝脏组织中总RNA的提取与鉴定 14 3．1．2鸡CNX和CRT基因扩增结果 ．．14 3．1．3鸡CNX和CRT基因序列的测序结果 14 3．1．4鸡CNX和CRT重组表达质粒的构建 14 3．1．5融合蛋白的表达、鉴定与纯化 ．．15 3．1．6多克隆抗体的制备与鉴定 16 3．2 LMH细胞的培养与增殖 ．．1 7 3．2．1 LMH细胞的培养 17 3．2．2 LMH细胞的增殖生长曲线 ．18 3．3硒拮抗镉致LMH细胞毒性最佳剂量的确定 ，．18 3．3．1硒、镉致LMH细胞半数抑制浓度(IC50) ．18 3．3．2硒与镉对LMH细胞形态影响的检测结果 19 3．3．3硒与镉对LMH细胞LDH活性影响的检测结果 ．．19 3．4硒拮抗镉致LMH细胞内质网应激效应的检测结果 20 3．5硒拮抗镉致LMH细胞自噬效应的检测结果 ．．21 3．5．1硒与镉对LMH细胞自噬泡影响的检测结果 21 3．5．2硒与镉对LMH细胞自噬标志基因表达影响的检测结果 ．22 3．6硒拮抗镉致LMH细胞钙稳态改变的检测结果 ．．23 3．6．1硒与镉对LMH细胞内游离钙离子含量影响的检测结果 ．23 3．6．2硒与镉对LMH细胞内钙调控相关基因表达影响的检测结果 ．23 3．6．3硒与镉对LMH细胞内CNX与CRT表达影响的检测结果 ．24 3．7钙稳态在硒拮抗镉致LMH细胞内质网应激的作用 25 3．7．1 2-APB对硒与镉处理LMH细胞活性影响的检测结果 ．．25 3．7．2 2．APB对硒与镉处理LMH细胞内质网应激影响的检测结果 ．．27 3．7．3 2-APB对硒与镉处理LMH细胞自噬影响的检测结果 ．．28 万方数据 目 目 录 3．7．4 2-APB对硒与镉处理LMH细胞钙稳态影响的检测结果 ．．30 4讨{念 ．．34 4．1鸡CNX和CRT多克隆抗体的制备 34 4．2硒拮抗镉致LMH细胞毒性的效应 ．34 4．3硒拮抗镉致LMH细胞内质网应激的