马铃薯遗传转化体系的优化及无机焦磷酸酶基因导入的研究作物遗传育种专业论文.docxVIP

优秀毕业论文 精品参考文献资料 甘肃农业大学2008 甘肃农业大学2008届硕士学位论文 摘 要 马铃薯(Solanum tuberosum L．)是重要的粮菜兼用和工业原料作物。马铃薯块 茎的休眠和发芽对于马铃薯的栽培、块茎生产和加工工业都极为重要。由于对块茎 休眠和发芽机理了解的欠缺，人工调控技术发展缓慢，从而严重制约了马铃薯种薯 生产的发展和块茎作为工业加工原料的充分利用。因此，研究块茎休眠和发芽的分 子机理及调控，对于马铃薯栽培、贮藏保鲜和产业发展等具有十分重要的意义。 无机焦磷酸酶(pyrophosphatase，PPase)是以无机焦磷酸(pyrophosphate，PPi) 为底物的水解酶，PPi也是联系马铃薯块茎细胞质和质体中蔗糖降解、淀粉合成以及 淀粉贮藏器官中糖酵解代谢的纽带，蔗糖代谢在两步酶促反应中需要PPi。因此，通 过调控细胞质中的PPi可以实现对马铃薯块茎休眠与发芽特性的调控。 本研究的主要目的是构建马铃薯无机焦磷酸酶(PPase)基因的植物表达载体， 并对农杆菌介导的马铃薯试管薯遗传转化体系进行优化，然后将PPase基因导入马铃 薯栽培品种中，以期对马铃薯块茎的休眠和发芽特性进行调控。取得的主要研究结 果如下： 1．将马铃薯PPase基因与原核表达载体pET．28a融合，构建了原核表达载体 pET．PPA，然后导入大肠杆菌BL21(DE3)中，经SDS．PAGE分析表明PPase基因 在大肠杆菌中能够表达。 2．将PPase基因分别与组成型启动子CaMV 35S、块茎特异表达启动子CIPP和 低温诱导表达型启动子rd29A融合，构建了植物表达载体pBI．SP、pBIC．SP和 pBIr-SP，通过冻融法导入根癌农杆菌LBA4404中，经酶切鉴定和PCR检测证明表 达载体已导入农杆菌中。 3．以马铃薯栽培品种甘农薯2号和Favorita为试验材料，利用固体培养、固液 培养和液体培养法进行了试管薯的诱导，并对其农杆菌介导的遗传转化体系进行了 优化研究。结果表明，固体培养、固液培养和液体培养法诱导的甘农薯2号试管薯 单瓶平均结薯数分别为4．6、4．4和6．5个，块茎平均直径分别为6。2、5．8和7．7 1Tim； Favorita单瓶平均结薯数为5．4、5．8和7．4个，平均直径分别达6．2、5．9和7．3 mm。 用浓度为OD600=O．5的菌液，侵染8 min，共培养2 d能够获得较高的转化频率，其 转化频率甘农薯2号和Favorita分别可达42．6％和36．8％。 4．以两个马铃薯栽培品种甘农薯2号和Favorita的试管薯为供体材料，分别用 II 甘肃农业大学2008 甘肃农业大学2008届硕士学位论文 组成型启动子CaMV 35S、块茎特异表达启动子CIPP和低温诱导表达型启动子rd29A 驱动的PPase基因表达载体pBI—SP、pBIC—SP和pBIr-SP进行遗传转化，获得了部分 转基因马铃薯。通过PCR扩增初步表明PPase基因已整合到马铃薯的基因组中。 关键词：马铃薯；PPase基因；原核表达；遗传转化 III 甘肃农业大学2008 甘肃农业大学2008届硕士学位论文 Summary Potato(Solanum tuberosum L．)is an important crop and industrial raw materials worldwide．Dormancy and sprouting of potato tuber are very important for potato cultivation，production and processing．However,the development of potato tuber production and the processing of tuber as industrial raw materials were seriously restricted because of lacking of understanding the mechanism of tuber dormancy and sprouting and slow developing technology of artificia regulation．Therefore，it has a great significance to study the molecular mechanism and regulation of tuber dormancy and sprouting for potato cultivation，storage and industrial development． Inorganic pyrophos